Kofeiinin saannin annos- ja aikavaikutukset ihmisen verihiutaleiden Adenosiini A2A -reseptoreihin

Kofeiini, jota löytyy eri lähteistä, kuten kahvista, teestä, suklaasta ja kolajuomista, on maailman laajimmin vaikuttava aine. Aikuisten ihmisten keskimääräinen kofeiinin kulutus vaihtelee eri kulttuureissa ja kansakunnissa 80-400 mg:sta henkilöä kohti päivässä.1 Kofeiini saa aikaan monenlaisia farmakologisia reaktioita, kuten lisääntyneen vireystilan, lyhentyneen psykomotorisen reaktioajan ja lisääntyneen unen latenssin ja heräämisajan, ja se voi myös vaikuttaa älylliseen suorituskykyyn.2 Lisäksi kofeiini aiheuttaa sileiden lihasten rentoutumista, lisää mahahapon eritystä ja katekoliamiinien vapautumista sekä lisää metabolista aktiivisuutta.3

Kofeiinin vaikutusten taustalla olevat tarkat mekanismit ovat edelleen puutteellisesti määriteltyjä. Vaikka fosfodiesteraasien esto saattaa vaikuttaa osaltaan kofeiinin vaikutuksiin,4 on yhä enemmän näyttöä siitä, että suurin osa tämän ksantiinin farmakologisista vaikutuksista johtuu A1-, A2A-, A2B- ja A3-alatyypeiksi nimettyjen adenosiinireseptorien antagonismista.5 Kofeiini vaikuttaa voimakkaimmin A2A-reseptoreihin, seuraavaksi voimakkaimmin A1-reseptoreihin, sitten A2B-reseptoreihin,6 ja heikkona antagonistina ihmisen A3-reseptoreihin. Adenosiinireseptorien eli A1- ja A2A-reseptorityyppien estäminen kofeiinilla estää endogeenisen adenosiinin vaikutusta useisiin fysiologisiin prosesseihin.7 Normaalioloissa veren adenosiinipitoisuudet näyttävät riittävän aktivoimaan A2A-reseptoreita verihiutaleissa. Hiljattain raportoitiin, että A2A-reseptori-knockout-hiirillä verihiutaleiden aggregaatio lisääntyi, mikä viittaa tämän reseptorin alatyypin merkitykseen verihiutaleiden toiminnassa8 . On siis ajateltavissa, että kofeiini voisi estää näitä tonaalisesti aktivoituneita A2A-reseptoreita verihiutaleissa ja muuttaa niiden adenosiinin säätelemiä toimintoja.

Kahvinjuonnin ja sydän- ja verisuonitautien, erityisesti sepelvaltimotaudin, välillä on jo vuosia epäilty olevan yhteys,9 mutta äskettäin on osoitettu, että kahvin tai kofeiinin nauttiminen ei lisää sepelvaltimotaudin tai aivohalvauksen riskiä.1011 Lukuisissa sydäninfarktia tarkastelevissa epidemiologisissa tutkimuksissa on todettu, että <5 kupillista kahvia päivässä ei ole haitallisia vaikutuksia, kun taas suuremmilla saantimäärillä tulokset ovat ristiriitaisia.12 Verenpainetautia sairastavilla potilailla ei havaittu haitallista lopputulosriskiä millään kofeiinin saantimäärällä.13

Biaggionin ym.14 tutkimuksessa todettiin, että toistuva kofeiiniannostus johtaa merkittäviin muutoksiin ihmisen verihiutaleiden toiminnallisissa vasteissa adenosiinireseptoriagonistille 5′-N-etyyli-karboksamidoadenosiinille (NECA). Kofeiinin poistaminen sai aikaan merkittävän vasemmanpuoleisen siirtymän NECA:n aiheuttamassa aggregaation estossa14. Tämän mukaisesti osoitimme hiljattain15 koehenkilöillä, joita hoidettiin 750 mg/d 1 viikon ajan, että kofeiinin krooninen saanti muuttaa verihiutaleiden aggregaatiota verihiutaleiden pinnalla sijaitsevien A2A-reseptorien regulaation seurauksena.

Tässä artikkelissa annamme lisänäyttöä siitä, että samankaltainen vaste on havaittavissa koehenkilöillä, joita on hoidettu kofeiinilla, jota on annettu erilaisina annoksina, esim. 600 mg/d 1 viikon ajan, tai annoksina, jotka ovat saaneet kofeiiniä 600 mg/päivä 1 viikon ajan tai annosteltuina pidemmän aikaa, esim. 2 viikon ajan. Tässä tutkimuksessa tämä tehtiin mittaamalla suoraan adenosiini-A2A-reseptorimuutoksia (tiheys ja affiniteetti) ja niiden toimintaa määrittämällä A2A-selektiivisen agonistin 2-heksinyyli-NECA:n (HE-NECA) vaikutus 1) cAMP-kertymän lisääntymiseen, 2) verihiutaleiden aggregaation estämiseen ja 3) solunsisäisten kalsiumtasojen vähenemiseen. Kroonisen käytön jälkeen (600 mg/d 1 viikon ajan tai 400 mg/d 2 viikon ajan) todettiin verihiutaleiden adenosiini-A2A-reseptorien säätelyä, joka korreloi vahvasti aggregaatiota estävien vaikutusten, cAMP-kertymän nousun ja solunsisäisten kalsiumtasojen laskun kanssa. Sitoutumis- ja toiminnallisissa parametreissa ei havaittu eroja koehenkilöillä, joita hoidettiin 400 mg/d 1 viikon ajan.

Menetelmät

Tutkimukseen osallistui 45 tervettä, tupakoimatonta, 25-45-vuotiasta koehenkilöä molemmista sukupuolista. Kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen antamisen jälkeen koehenkilöitä pyydettiin pidättäytymään ruokavaliossa nautittavista metyyliksanteineista ≥ 2 viikon ajan. Heidät jaettiin kolmeen ryhmään (15 koehenkilöä kukin) kofeiinin annosteluohjelman (eli annoksen ja annostelun keston) mukaan: 200 mg suun kautta 2 kertaa päivässä 7 päivän ajan (ryhmä 1); 200 mg suun kautta 2 kertaa päivässä 14 päivän ajan (ryhmä 2); ja 200 mg suun kautta 3 kertaa päivässä 7 päivän ajan (ryhmä 3). Koehenkilöiden verihiutaleet tutkittiin ennen kofeiiniannoksen aloittamista (päivä 0) ja 1, 12, 60 ja 108 tunnin kuluttua viimeisestä kofeiiniannoksesta. Erityisesti 1 tunnin aikapiste tutkittiin vain ryhmässä, joka sai suurimman kofeiiniannoksen (600 mg/d). EC50- ja IC50-arvoja toiminnallisissa määrityksissä ei voitu saada 1 tunnin kohdalla johtuen käytännön ongelmista, jotka liittyivät veren liialliseen ottamiseen kapealla ajanjaksolla (1-12 tuntia).

SCH 58261:n sitoutumismääritys ihmisen verihiutaleiden membraaneissa

Ihmisen verihiutaleiden membraanit valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla16 , ja niitä käytettiin radioligandien sitoutumismäärityksiä varten SCH 58261:llä Varani ym. mukaan.17 Saturaatiotutkimuksissa ihmisen verihiutaleiden kalvoja inkuboitiin 8-10 eri SCH 58261 -pitoisuuden kanssa, jotka vaihtelivat välillä 0,01-10 nmol/l. Epäspesifinen sitoutuminen määritettiin 10 μmol/l NECA:n läsnäollessa. Kun näytteitä oli inkuboitu 60 minuuttia 4 °C:ssa, ne suodatettiin Whatman GF/B -suodattimien läpi Micro-Mate 196 Cell Harvesterilla (Packard Instrument Co). Saturaatiokokeiden tietojen tietokoneanalyysiin käytettiin painotettua epälineaarista pienimmän neliösumman käyrän sovitusohjelmaa, LIGAND,18.

CAMP-tasojen mittaaminen ihmisen verihiutaleissa

Pestyjä ihmisen verihiutaleita, jotka oli saatu terveiden vapaaehtoisten perifeerisestä verestä, valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla.16 Verihiutaleita (6×104-8×104 solua) inkuboitiin 1,0 U adenosiinideaminaasia/ml, 0,5 mmol/l 4-(3-butoksi-4-metoksibentsyyli)-2-imidatsolidinonia (Ro 20-1724) fosfodiesteraasi-inhibiittorina ja 6-8 eri pitoisuutta HE-NECA:ta. EC50-arvot saatiin pitoisuus-vastekäyristä sen jälkeen, kun riippuvaiset muuttujat oli muunnettu log-logit-muunnoksella painotetulla pienimmän neliösumman menetelmällä.19 Lopullisesta vesiliuoksesta testattiin cAMP-pitoisuudet kilpailuproteiinien sitoutumismäärityksellä.15

Trombosyyttien aggregaatiomääritys

Sitrattua ihmisverta sentrifugoitiin 200 g:n paineessa 10 minuuttia verihiutaleilla rikkaan veriplasman aikaansaamiseksi ja 2 500 g:n paineessa 20 minuuttia verihiutaleilla köyhän plasman aikaansaamiseksi. Ihmisen verihiutaleiden määrä laskettiin Coulter-laskurilla malli S8/80 (Coulter Electronics Inc.), ja se säädettiin 2,5×108/ml-3,5×108/ml:iin autologisella verihiutaleettomalla plasmalla. Verihiutaleiden aggregaatio suoritettiin Bornin turbidimetrisen tekniikan20 mukaisesti DIC PA-3220 Aggrecorderilla (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Kun verihiutalepitoista plasmaa oli inkuboitu 3 minuutin ajan 6-8 eri pitoisuuden HE-NECA:n kanssa, verihiutalepitoista plasmaa aggregoitiin 37 °C:ssa jatkuvassa sekoituksessa ADP:n kanssa. Samanlaisia kokeita tehtiin ADP:llä eri pitoisuuksilla (100 nmol/l – 100 μmol/l). Kvantitatiiviseen analyysiin käytettiin maksimaalista aggregaatiota, joka rekisteröitiin 5 minuuttia ADP:n lisäämisen jälkeen, ja eston prosenttiosuus laskettiin suhteessa kontrolliarvoihin.21

Sytoplasmisen vapaan Ca2+ -pitoisuuden mittaukset

Sytosolisen vapaan kalsiumin pitoisuus mitattiin fura 2 -tekniikalla Paulin ym. mukaan.22 Lyhyesti sanottuna verihiutaleita inkuboitiin täydellisessä pimeydessä 30 minuutin ajan 37 °C:ssa 1 μmol/L fura 2-AM:n kanssa ja sekoitettiin magneettisesti fluorimittarikyvetteissä (LS50, Perkin Elmer, Ltd) pitoisuudella 108/ml 250 μmol/L sulfinpyratsonin läsnä ollessa. Solunsisäinen Ca2+-konsentraatio (i) määritettiin herätesuhteella 340/380 ja emissioaallonpituudella 505 nm.

Statistinen analyysi

Aineiston analyysi suoritettiin yksisuuntaisella ANOVA:lla. Kofeiinilla käsiteltyjen ryhmien (12, 60 ja 108 tuntia) ja kontrolliryhmien välisen eron analyysi tehtiin Studentin t-testillä (parittelematon analyysi). Erot katsottiin merkitseviksi, kun arvo oli P<0,01. Kaikki tiedot ilmoitetaan keskiarvoina±SEM.

Tulokset

Hermosolut kolmesta koehenkilöryhmästä kerättiin ennen kofeiinin annon aloittamista (päivä 0, kontrolli) ja 1, 12, 60 ja 108 tuntia viimeisen annoksen jälkeen (kofeiinin vieroitus). Taulukossa on yhteenveto 3 koehenkilöryhmän sitoutumis- ja toiminnallisten kokeiden tuloksista.

Ryhmä 1 (400 mg/d 1 viikon ajan)

Sitoutumisparametrit osoittivat, että kontrollin Bmax-arvo oli 105±6 fmol/mg proteiinia ja KD-arvo 1,28±0,08 nmol/L. Kontrolliverihiutaleissa HE-NECA lisäsi cAMP-tasoja EC50-arvolla 60±5 nmol/L ja esti (1) aggregaatiota IC50-arvolla 86±10 nmol/L ja (2) kalsiumtasoja IC50-arvolla 104±8 nmol/L. Sitoutumis- ja toiminnallisissa parametreissa ei havaittu tilastollisesti merkitseviä eroja 12, 60 ja 108 tunnin kuluttua kofeiinin vieroituksesta (taulukko).

Ryhmä 2 (400 mg/d 2 viikon ajan)

Sitoutumisparametrit osoittivat, että kontrollin Bmax-arvo oli 110±3 fmol/mg proteiinia ja KD-arvo 1,21±0,09 nmol/L. 12 ja 60 tuntia kofeiinin vieroituksen jälkeen reseptoritiheydet, Bmax, kasvoivat molemmissa ajankohdissa noin 20 %, mutta KD-arvot pysyivät muuttumattomina. Toiminnalliset kokeet osoittivat, että adenosiini A2A-reseptorin agonisti HE-NECA oli huomattavasti tehokkaampi lisäämään verihiutaleiden cAMP:ia (eli EC50-arvot olivat 45 % ja 65 % pienemmät 12 ja 60 tuntia kofeiinin vetämisen jälkeen kuin kontrolliarvot). Samanlainen suuntaus havaittiin aggregaatiokokeissa ja sytoplasman vapaan kalsiumin pitoisuusmittauksissa saaduissa IC50-arvoissa (taulukko).

Ryhmä 3 (600 mg/d 1 viikon ajan)

Kokonaisuutena saatiin samankaltaisia tietoja kuin ryhmässä 2. SCH 58261 sitoutui yhteen ainoaan affiniteettiluokkaan kontrolleista peräisin olevien verihiutaleiden kalvojen kohtiin, joiden Bmax-arvoksi saatiin 100±4 fmol/mg proteiinia ja joiden KD-arvoksi saatiin 1,27±0,09 nmol/L. Kuten kuvassa 1A on esitetty, 1, 12, 60 ja 108 tuntia kofeiinin vetämisen jälkeen kerätyistä verihiutaleista peräisin olevissa kalvoissa radioligandi sitoutui samalla affiniteetilla, mutta sitoutumiskohtien määrä (Bmax) oli merkittävästi (P<0,01) suurempi. Rinnakkaistutkimuksissa määritettiin verihiutaleiden toiminnalliset vasteet A2A-reseptoriagonistille HE-NECA. Kuten taulukossa on yhteenveto, HE-NECA:n teho (1) lisätä cAMP:n muodostumista, (2) estää ADP:n aiheuttamaa verihiutaleiden aggregaatiota ja (3) alentaa kalsiumtasoja lisääntyi merkittävästi verihiutaleissa, jotka saatiin 12, 60 ja 108 tuntia kofeiinin vetämisen jälkeen (Kuva 1B, 1C ja 1D). Kokeet tehtiin myös sen määrittämiseksi, liittyisikö A2A-reseptorien tiheyden lisääntymiseen ADP:n aggregaatiota indusoivan tehon ja/tai tehokkuuden väheneminen. ADP:n EC50-arvot verihiutaleiden aggregaation stimuloimiseksi 12, 60 ja 108 tuntia kofeiinin poistamisen jälkeen olivat vastaavasti 0,7±0,2, 0,9±0,1 ja 0,8±0,1 μmol/l, arvot, jotka eivät eronneet merkitsevästi 0,9±0.2 μmol/L, jotka saatiin kontrollien verihiutaleista (kuva 2).

Keskustelu

Kofeiinin pitkäaikaisen annostelun vaikutukset ihmisillä ja eläimillä ja sen merkitys kofeiinin vaikutusten sietokyvylle ovat kiistanalaisia. Joissakin tutkimuksissa, jotka osoittivat A1-reseptorien lisääntymistä hiiren aivoissa, löytyi todisteita A1-reseptorien annosriippuvaisesta ylössäätelystä kofeiinin vaikutuksesta.23 Toiset tutkimukset osoittivat A2A-reseptorien ylössäätelyä, mikä viittaa kofeiinin saannin adaptiiviseen vaikutukseen.24 Lisäksi krooninen kofeiininkäyttö voi johtaa verihiutaleiden aggregaatiokyvyn vähenemiseen verihiutaleiden pinnalla sijaitsevien A2A-reseptoreiden ylössäätelyn seurauksena.14 Näillä reseptoreilla on potentiaalinen rooli patofysiologisissa prosesseissa, kuten aggregaatiossa ja trombogeneesissä. Vaikka tällaiset muutokset voivat osaltaan vaikuttaa verihiutaleiden toiminnassa tapahtuviin muutoksiin, kofeiinin sietokyky ei muuta tämän ksantiinin tehoa adenosiinin vaikutusten kilpailevana antagonistina.25 Sietokykyyn voi liittyä muitakin muutoksia, kuten reseptorin affiniteetin siirtyminen korkea-affiniteettiseen tilaan, muutokset G-proteiinien tasoissa tai näiden proteiinien kytkeytymisessä adenosiinireseptoreihin tai reseptorin pitkäaikainen miehitys.26 Sietokykyyn voi liittyä muita muutoksia. Kofeiinin vieroitusoireita esiintyy ihmisillä; tyypillisesti niitä ovat päänsärky, väsymys, apatia ja uneliaisuus.9 Erityisesti kofeiini lisää plasman adenosiinipitoisuutta, ja sen pieneneminen antagonistin vieroituksen jälkeen viittaa reseptorivälitteiseen plasman adenosiinipitoisuuden säätelyyn.27 Iskemian ja/tai hypoksian aikana adenosiinilla on myös neuroprotektiivisia vaikutuksia. Aikuisten aivoissa krooninen kofeiinihoito, joka johtaa adenosiinireseptorien ylössäätelyyn, vähentää iskeemisiä vaurioita, kun taas akuutti altistus (reseptoriantagonistinen vaikutus) lisää iskeemisiä vaurioita.28

On osoitettu, että kofeiinin krooninen saanti muuttaa verihiutaleiden vastetta adenosiinin vaikutuksille.14 Kofeiinin toistuva anto (750 mg/d 1 viikon ajan) paljasti A2A-reseptorin tiheyden lisääntymisen, johon liittyi verihiutaleiden vasteiden herkistyminen, kuten cAMP:n kertymisen lisääntyminen ja verihiutaleiden aggregaation väheneminen.15 Tämän tutkimuksen tavoitteena oli määrittää kofeiiniannoksen ja annostelun keston vaikutus sitoutumis- ja toiminnallisiin parametreihin. Näin ollen tutkimme muutoksia adenosiini-A2A-reseptorien tiheydessä ja affiniteetissa ihmisen verihiutaleiden kalvoissa henkilöillä, joita oli hoidettu eri annoksilla (400 tai 600 mg/d) eri kofeiinin saantiaikojen ajan (1 tai 2 viikkoa). Tarkemmin sanottuna tutkimme kontrollihenkilöitä (ennen kofeiinin antoa) ja kofeiinilla käsiteltyjä (1, 12, 60 ja 108 tuntia viimeisen kofeiiniannoksen jälkeen) koehenkilöitä.

Hoito 400 mg/d kofeiinilla 1 viikon ajan ei muuttanut A2A-reseptorien sitoutumista ja toiminnallisia parametreja. Hoito 400 mg/d 2 viikon ajan tai 600 mg/d 1 viikon ajan johti kuitenkin (1) adenosiini A2A:n sitoutumiskohtien merkittävään lisääntymiseen (upregulaatioon), (2) cAMP:n kertymisen lisääntymiseen, (3) antiaggregaatiovaikutuksen lisääntymiseen ja (4) A2A-reseptorin agonistin HE-NECA:n aikaansaaman kalsiumtason alenemiseen.

A2A-reseptoreiden upregulaatio johtuu todennäköisesti uusien reseptoreiden syntetisoimisesta esiasteiden erilaistumisen aikana. Tämä tulkinta perustuu in vitro -kokeiden tuloksiin, jotka osoittavat, että kontrollihenkilöiden trombosyyttiplasman inkubointi 6 tai 12 tunnin ajan kofeiinin tai SCH 58261:n kanssa ei vaikuttanut sitoutumisparametreihin.15 Kroonisen kofeiinin saannin aiheuttama adenosiini-A2A-reseptorien regulaatio voidaan tulkita osoitukseksi siitä, että endogeenisella adenosiinilla on ihmisen verihiutaleisiin tonisoiva vaikutus, ja antagonistin läsnäolo tasapainotetaan A2A-reseptorien regulaatiolla. Aikuisilla kofeiini imeytyy tehokkaasti ruoansulatuskanavasta; huippupitoisuudet plasmassa ovat 15-120 minuutin kuluttua nauttimisesta, ja kofeiinin puoliintumisaika on 2,5-4,5 tuntia7. Adenosiini-A2A-reseptorien lisääntyminen, joka havaittiin 1 tunti viimeisen kofeiinihoitoannoksen jälkeen, oli samanlainen kuin se, joka saatiin 12 tai 60 tuntia kofeiinin vieroituksen jälkeen, mikä osoittaa, että vieroitus ei ollut välttämätön A2A-reseptoreiden ylössäätelylle.

Tämän tutkimuksen toisena tavoitteena oli määrittää, korreloivatko sitoutumisparametrien muutokset funktionaalisen vasteen (toiminnallisten vasteiden) muutosten kanssa. Havaittiin, että verihiutaleiden aggregaatio liittyi adenylaattisyklaasin aktivoitumiseen ja solunsisäisten kalsiumpitoisuuksien nousuun. HE-NECA:n teho 12, 60 ja 108 tuntia kofeiinin vetämisen jälkeen lisääntyi merkittävästi kontrolliryhmään verrattuna. Tämä havainto osoittaa, että eri kofeiiniannosten toistuva antaminen johtaa merkittäviin muutoksiin A2A-reseptorien määrässä verihiutaleiden pinnalla, mihin liittyy lisääntynyt reagointikyky reseptorin stimulaatioon. Klassinen adenosiini A2A-reseptori on vastuussa adenosiinin ja sen analogien antiaggregaatio-ominaisuuksista, mikä on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että aggregaatio on tehokkaampaa hiirillä, joilta A2A-reseptorit puuttuvat.8 Kasvavilla ADP-pitoisuuksilla indusoitu verihiutaleiden aggregaatio ei kuitenkaan eronnut merkitsevästi kontrolli- ja kofeiinilla käsiteltyjen henkilöiden välillä. Yksi mahdollinen selitys jälkimmäiselle havainnolle on se, että määritysmediassa ei ole riittävästi adenosiinia vasteen aikaansaamiseksi. Vaihtoehtoisesti kofeiinilla käsitellyillä koehenkilöillä reseptorien ylössäätelyn suuruus (eli reseptorien määrä) ei ollut riittävä aiheuttamaan ADP:n aiheuttaman aggregaation pitoisuus-vastekäyrän siirtymistä. Kun endogeenisen adenosiinin pitoisuudet kasvavat, kuten sydänlihasiskemian aikana, solunulkoinen adenosiinipitoisuus nousee kuitenkin nopeasti tasolle, joka riittää vaikuttamaan ylösreguloituihin reseptoreihin, ja sillä voi olla suurempia verihiutaleita estäviä vaikutuksia kuin kontrollissa. Näin ollen on mahdollista, että krooninen kofeiinin käyttö annoksina, jotka eivät ole kaukana keskimääräisestä ravinnosta, voi johtaa paradoksaaliseen verihiutaleiden aggregaatiokyvyn vähenemiseen iskemian aikana.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että kaikki tiedot yhdessä antavat lisänäyttöä siitä, että kofeiinin krooninen saanti muuttaa verihiutaleiden vastetta adenosiinin vaikutuksille. Tämän tutkimuksen tärkein havainto on, että kroonisen kofeiininkäytön vaikutukset verihiutaleiden toimintaan ovat riippuvaisia sekä annoksesta että hoidon kestosta, ja niiden taustalla on verihiutaleiden aggregaabeliuden väheneminen, joka johtuu adenosiini-A2A-reseptorien ylössäätelystä.

Jalkahuomautukset