Aikuisen ihmisen sydämen solut

Tietojen raportointi

Otoksen koon ennalta määrittämiseen ei käytetty tilastollisia menetelmiä. Kokeet eivät olleet satunnaistettuja, eivätkä tutkijat olleet sokkoutettuja allokaatiolle kokeiden ja tulosten arvioinnin aikana.

Luovutuskudosten tutkimuseettinen eettisyys

Sydänkudokset (luovuttajat D1-D7 ja D11) käsiteltiin Wellcome Sanger -instituutissa (Hinxton, Iso-Britannia), ja ne saatiin kuolleilta elinsiirtoelinten luovuttajilta sen jälkeen, kun tutkimuseettinen toimikunta oli hyväksynyt tutkimuksen eettisen komitean lausunnon (ref. 15/EE/0152, Itä-Englannissa, Cambridgessa, eteläisessä tutkimuseettisessä toimikunnassa), ja kun luovuttajan perheet olivat antanut siihen suostumuksensa. Sydänkudokset (luovuttajat H2-H7) käsiteltiin Harvard Medical Schoolissa (Boston, Massachusetts, Yhdysvallat), ja ne saatiin kuolleilta elinluovuttajilta sen jälkeen, kun tutkimuseettinen lautakunta oli hyväksynyt ne (University of Alberta, Edmonton, Kanada) (Pro00011739). Luovuttajaperheiden tietoinen suostumus hankittiin instituution HOPE-ohjelman (Human Organ Procurement and Exchange Program) kautta. Kaikkien luovuttajien kardiovaskulaarinen anamneesi oli merkityksetön (lisätaulukko 1).

Kudosten hankinta ja käsittely

Kudokset hankittiin brittiläisiltä ja pohjoisamerikkalaisilta luovuttajilta (D1-7 ja 11, H2-7) verenkiertoelinten kuoleman (DCD) (D2, D4-D7 ja D11) ja aivokuoleman (DBD) (D1, D3, H2-H7) jälkeen. Yhdistyneessä kuningaskunnassa DCD-luovuttajien kohdalla rintakehä avataan viiden minuutin odottelun jälkeen ja DBD-luovuttajien kohdalla rintakehä avataan, aortta suljetaan ristiin ja sydämestä otetaan näytteet. Pohjoisamerikkalaisille DBD-luovuttajille aortta suljetaan ristiin, kylmää kardioplegiaa (Celsior) annetaan paineella aortan kautta lyönnin pysäyttämiseksi, sydän poistetaan, huuhdellaan kylmällä suolaliuoksella ja otetaan näytteet. Kaikki luovuttajanäytteet olivat kokopaksuisia sydänlihasbiopsioita vasemmasta ja oikeasta eteisestä, vasemmasta ja oikeasta kammiosta, kammioväliseinästä ja kärkikammiosta, ja suuret epikardiaaliset rasvakertymät jätettiin tarkoituksellisesti pois. Yksittäisten ytimien eristämiseen käytetyt näytteet pakastettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa. Yksittäisten solujen eristäminen ja CD45+-rikastaminen suoritettiin juuri kerätyistä näytteistä. Ytimien ja solujen eristämisen jälkeen jäljelle jäänyt kudos fiksoitiin formaliinilla tai pakastettiin OCT:ssä lisätutkimuksia varten.

Kaikki kudokset säilytettiin ja kuljetettiin jäässä aina pakastamiseen tai kudoksen dissosiaatioon asti, jotta transkription hajoaminen olisi mahdollisimman vähäistä. Aiemmat tutkimukset GTEx-konsortion kudosten kuolemanjälkeisestä stabiilisuudesta irtotavarakudoksissa68 ja yksittäisissä soluissa69 viittaavat siihen, että kudoksissa tapahtuu vain vähäisiä muutoksia ensimmäisten 24 tunnin aikana kuoleman jälkeen, kun ne säilytetään kylmässä.

Yksittäisten ytimien eristäminen

Yksittäiset ytimet saatiin pikajäädytetyistä kudoksista mekaanisella homogenisoinnilla aiemmin kuvatulla tavalla70. Kudokset homogenisoitiin 7 ml:n lasisella Dounce-kudosmyllysarjalla (Merck) 8-10 löysällä pestillä (A) ja 8-10 tiukalla pestillä (B) homogenointipuskurissa (250 mM sakkaroosia, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 1 mM ditiotiotreitolia (DTT), 1 × proteaasi-inhibiittorilla (1 × proteaasi-inhibiittori, 0,0 %).4 U μl-1 RNaseIn, 0,2 U μl-1 SUPERaseIn, 0,1 % Triton X-100 nukleaasivapaassa vedessä). Homogenaatti suodatettiin 40 μm:n solusiivilän (Corning) läpi. Sentrifugoinnin (500 g, 5 min, 4 °C) jälkeen supernatantti poistettiin ja pelletti resuspendoitiin säilytyspuskuriin (1 × PBS, 4 % naudan seerumin albumiinia (BSA), 0,2 U μl-1 Protector RNaseIn). Ytimet värjättiin NucBlue Live ReadyProbes -reagensseilla (ThermoFisher) ja Hoechst-positiiviset yksittäiset ytimet puhdistettiin fluoresoivalla aktivoidulla solujen lajittelulla (FACS) käyttäen influx-, XDP- tai FACSAria-menetelmää (BD Biosciences) (täydentävä kuva 1). Ytimien puhdistus ja eheys tarkistettiin mikroskoopilla, ja ytimet käsiteltiin edelleen Chromium Controller -laitteella (10X Genomics) valmistajan protokollan mukaisesti.

Yksittäisten solujen valmistus

Sydänkudokset (0.2-0,9 g) siirrettiin sydänliuoksesta hellävaraisiinMACS C-putkiin (Miltenyi Biotec), jotka sisälsivät entsymaattisen digestion perusliuosta (100 μg ml-1 liberaasi TH Research grade ja 50 μg ml-1 DNaasi I, HBSS 10 mM HEPES ja 30 mM tauriinia)71. Kudokset hienonnettiin saksilla (FST) ja sulatettiin automaattisesti lämmittimillä varustetulla gentleMACS Octo Dissociatorilla (Miltenyi Biotec). Kardiomyosyyttipoistettu yksisolususpensio pestiin perusliuoksella, joka sisälsi 20 % naudan sikiöseerumia (FBS) (Gibco), suodatettiin 70 μm:n nailonsiivilän läpi (BD Falcon), kerättiin sentrifugoimalla (330 g, 10 min, 4 °C) ja resuspendoitiin perusliuokseen, joka sisälsi 0,2 % FBS:ää (Gibco). Solut laskettiin manuaalisesti kolme kertaa Trypan sinisen poissulkemisen avulla jokaisen sentrifugoinnin jälkeen ja resuspendoitiin vähintään 2 × 106 ml-1:n pitoisuuteen. Yksittäiset solut käsiteltiin Chromium Controllerilla (10X Genomics) valmistajan protokollan mukaisesti.

CD45+-solujen rikastaminen

Solususpensio valmistettiin edellä kuvatulla tavalla, minkä jälkeen se leimattiin anti-human CD45 monoklonaaliseen vasta-aineeseen konjugoituneilla mikrohelmillä valmistajan protokollan mukaisesti (Miltenyi Biotec). Lyhyesti sanottuna enintään 107 solua inkuboitiin 15 minuutin ajan 4 °C:ssa 80 μl:ssa PBS-, BSA-, EDTA-puskuria (1 × PBS pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA), joka sisälsi 20 μl CD45-mikrohelmiä. Solususpensio pestiin kerran PBS, BSA, EDTA-puskurilla ja kerättiin sentrifugoimalla (330 g, 10 min, 4 °C). Resuspendoidut solut levitettiin MACS LS -pylväisiin (Miltenyi Biotec). CD45-depletoitu solufraktio hylättiin kolmen PBS-, BSA- ja EDTA-puskurilla tehdyn pesun jälkeen, ja CD45+-solufraktio kerättiin PBS-, BSA- ja EDTA-puskurissa poistamalla pylväät magneettikentästä. CD45+-solut laskettiin ja resuspendoitiin PBS-, BSA- ja EDTA-puskurissa konsentraatioon, joka oli vähintään 2 × 106 millilitrassa, ennen jatkokäsittelyä Chromium Controller -ohjaimella (10X Genomics) valmistajan protokollan mukaisesti.

Chromium 10X -kirjaston valmistelu

Yksittäiset solut ja ytimet laskettiin manuaalisesti Trypan-sinisen poissulkemisella tai automaattisesti Countess II:lla (Life Technologies) käyttäen vähintään kahta erillistä laskentaa. Solu- tai ydinsuspensio säädettiin tasolle 400-1 000 solua mikrolitrassa ja ladattiin Chromium Controller -laitteeseen (10X Genomics) siten, että tavoiteltu solujen tai ytimien talteenotto oli 4 000-10 000 solua reaktiota kohti. 3′-geeniekspressiokirjastot valmistettiin valmistajan v2- tai v3 Chromium Single Cell Reagent Kits -sarjojen (10X Genomics) ohjeiden mukaisesti. cDNA:n ja lopullisten kirjastojen laadunvalvonta tehtiin Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent) tai 4200 TapeStation System (Agilent) -järjestelmällä. Kirjastot sekvensoitiin käyttäen HiSeq 4000 (Illumina) -laitteistoa Wellcome Sanger Institutessa ja NextSeq 500 (Illumina) -laitteistoa Harvard Medical Schoolissa siten, että lukusyvyys oli vähintään 20 000-30 000 lukuparia solua tai ydintä kohti (lisätaulukko 22).

Spatiaalinen validointi käyttäen smFISH:ää RNAscope-koettimilla

Formaliiniin kiinnitettyjen parafiiniin upotettujen (FFPE) näytteiden valmistuksessa tuore kudos kiinnitettiin neutraalipuskuroidussa 10-prosenttisessa formaliinissa 18-36 tunnin ajan ja upotettiin sen jälkeen parafiinilohkoihin. Jäädytetyt ja pakastetut kudosnäytteet kiinnitettiin 4-prosenttiseen paraformaldehydiin (ThermoFisher). Leikkeet leikattiin 5 μm:n paksuisiksi mikrotomilla ja asetettiin SuperFrost Plus -lautasille (VWR). FFPE-kudosnäytteet värjättiin automaattisesti BOND RX:llä (Leica) ja RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Assayllä (ACDBio) valmistajan protokollan mukaisesti. Kiinnijäädytetyt kudoslasit käsiteltiin RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v1 (ACDBio) -protokollan mukaisesti. RNAscope-valmiit tai räätälöidyt kohdekoettimet ajettiin rinnakkain multipleksipositiivisten ja -negatiivisten kontrollien kanssa (laajennetut tiedot, kuva 12b, lisätaulukko 23). Kaikki tumat värjättiin DAPI-värjäyksellä. Kaikki FFPE-kudoslevyt kuvattiin Opera Phenix High-Content -konfokaalisella seulontajärjestelmällä (Perkin Elmer), jossa oli 1 μm:n z-askel ja 20-kertainen vesi-immersio-objektiivi (NA 0,16, 0,299 μm per pikseli). Kanavat: DAPI (heräte 375 nm, emissio 435-480 nm), Atto 425 (heräte 425 nm, emissio 463-501 nm), opal 520 (heräte 488 nm, emissio 500-550 nm), opal 570 (heräte 561 nm, emissio 570-630 nm), opal 650 (heräte 640 nm, emissio 650-760 nm). Kiinnijäädytetyt ja pakastetut kudoslevyt kuvattiin LSM710-konfokaalimikroskoopilla (Zeiss) ja 40 × öljyimmersio-objektiivilla (1,3 öljy, DIC III). Kanavat: DAPI (heräte 375 nm, emissio 435-480 nm), Alexa Fluor 488 (heräte 492 nm, emissio 517 nm), Atto 550 (heräte 560 nm, emissio 575 nm) ja Atto 647 (heräte 649 nm, emissio 662 nm). Visualisointi ja taustan poisto (liikkuvan pallon säde) tehtiin käyttäen Fiji/ImageJ72:ta. Pseudovärejä käytettiin parempaan visualisointiin.

Haematoksyliini- ja eosiinivärjäys

Kudosnäytteet pakastettiin tuoreena isopentaanissa (ThermoFisher) -80 °C:ssa ja upotettiin OCT:hen (VWR). Leikkeet leikattiin mikrotomilla 10 μm:n paksuisiksi, asetettiin SuperFrostPlus-levyille (VWR) ja käsiteltiin edelleen tavanomaisen hematoksyliini- ja eosiinivärjäysprotokollan mukaisesti (Laajennetut tiedot, kuva 12a).

Luustolihaskudoksen otto

Lihaksenäytteet otettiin vasemman puolen toisen ja kolmannen kylkiluun väliltä. Tämä on tyypillisesti syvimmästä lihaskerroksesta (kauimpana ihosta). Näytteet kerättiin suoraan kylmäkonservointiliuokseen.

Luurankolihaksen ytimien eristäminen

Lihaskudos pestiin 1 × PBS:llä, puhdistettiin näkyvästä rasvakerrostumasta ja hienonnettiin niin, että saatiin noin 1 mm3 :n kokoisia palasia. Näytettä kohden noin 0,3 g jauhettua kudosta homogenisoitiin 3 ml:ssa puskuria A (250 mM sakkaroosia, 10 mg ml-1 BSA, 5 mM MgCl2, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasIn, 1 × proteaasi-inhibiittori) käyttäen Dounce-kudosmyllylaitetta (Merck) 50 lyönnillä löysällä pestillä (A). Homogenaatti suodatettiin 100 μm:n solusiivilän (Corning) läpi, ja siivilä pestiin ensin 1 ml:lla ja sitten 750 μl:lla puskuria A. Triton X-100:n (lopullinen konsentraatio 0,5 %) lisäämisen jälkeen seos homogenisoitiin edelleen 50 iskulla tiukalla pestillä (B). Kun ytimet oli suodatettu 40 μm:n siivilän läpi, ne sentrifugoitiin (3 000 g, 5 min, 4 °C), resuspendoitiin 1 ml:aan puskuria B (320 mM sakkaroosia, 10 mg ml-1 BSA, 3 mM CaCl2, 2 mM magnesiumasetaattia, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1 × proteaasi-inhibiittori, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasin) ja puhdistettiin 27 %:n Percoll-gradienttiliuoksella. Percoll-seos sentrifugoitiin 20 000 g:ssa (15 min, 4 °C) ja pelletti resuspendoitiin 200 μl:aan puskuria B, minkä jälkeen se sentrifugoitiin (20 000 g, 3 min, 4 °C). Trypan Blue -värjäyksen jälkeen ehjät tumat laskettiin hemosytometrillä. Ytimet profiloitiin kromiohjaimella (10X Genomics) valmistajan protokollan mukaisesti.

Yksittäisten solujen eristäminen luurankolihaksesta

Lihaskudos pestiin 1 × PBS:llä, puhdistettiin näkyvistä rasvakertymistä ja hienonnettiin. Sitten 2 g jauhettua kudosta siirrettiin sulatuspuskuriin 1 (750 U ml-1 kollagenaasi tyyppi 2 1× PBS:ssä) ja inkuboitiin 37 °C:ssa vesihauteessa 90 minuutin ajan. Osittain sulanut kudos kerättiin sentrifugoimalla (650 g, 5 min, 4 °C) ja pelletti suspendoitiin uudelleen sulatuspuskuriin 2 (100 U ml-1 kollagenaasi tyyppi 2, 2 U ml-1 dispaasi PBS:ssä). Kun pilkkomista oli inkuboitu 30 minuuttia 37 °C:ssa vesihauteessa, pilkkominen lopetettiin lisäämällä 2 % FBS:ää. Solut suodatettiin 100 μm:n ja 40 μm:n nailonsiivilän (BD Falcon) läpi, kerättiin sentrifugoimalla (650 g, 4 °C, 3 min) ja pestiin 1 × PBS:llä, 2 % FBS. Tämän jälkeen solujen puhdistukseen käytettiin 20 prosentin Percoll-gradienttia (15 000g, 4 °C, 20 min). Soluja sisältävä kerros kerättiin, pestiin PBS:llä, joka sisälsi 2 % FBS:ää, ja elinkykyiset solut laskettiin Trypan Blue -poissulkemisella hemosytometrillä. Ytimet profiloitiin kromiohjaimella (10X Genomics) valmistajan protokollan mukaisesti.

Menetelmien keskeiset resurssit -taulukko on lisätaulukossa 24.

Transkriptomikartoitus

Sekvensoinnin jälkeen näytteet demultipleksattiin ja tallennettiin CRAM-tiedostoina. Kukin näyte kartoitettiin 10X Genomicsin toimittamaan ihmisen referenssigenomiin (GRCh38 v.3.0.0) käyttäen CellRanger-pakettia (v.3.0.1) oletusparametreilla. Yksisoluiset näytteet kartoitettiin referenssiä vastaan sellaisena kuin se toimitettiin. Yhden ytimen näytteet, pre-mRNA:n referenssi, luotiin käyttäen 10X Genomicsin ohjeita (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references).

Laskentatietojen käsittely

Kartoituksen jälkeen näytteet kustakin tietolähteestä (yhden ytimen näytteet, yhden solun näytteet ja CD45+-solun näytteet) ryhmiteltiin yksittäisiksi AnnData-objekteiksi ketjuttamalla raw_feature_bc_matrix_h5.h5 ja lisäämällä niihin asianmukaiset metatietotiedot. Kullekin tietolähdeobjektille laskettiin yksilöllisten molekyylitunnisteiden (UMI) keskiarvo (n_counts), jota käytettiin tyhjien pisaroiden kynnysarvona.

Doublettien havaitseminen

Tyhjien pisaroiden poistamisen jälkeen sovelsimme scrublet73-ohjelmaa antaaksemme kullekin solulle dublettien pisteytyksen (scrublet_score). Nämä solut klusteroitiin ja visualisoitiin UMAP-menetelmällä74. Lisäksi kukin solu käsiteltiin dublettien havaitsemista varten käyttäen perkolaatiomenetelmää, jotta dublettien havaitseminen parani75.

Solujen laadunvalvonta ja suodatus

Jokaista tietolähdettä käsiteltiin ja annotoitiin erikseen lähdekohtaisten laatuerojen huomioon ottamiseksi. Nämä mittarit sisältyvät kovariaatteina jatkokäsittelyä varten. Solujen kokonaismäärä ja CD45+-solut suodatettiin lukumäärän (500 < n_counts <15 000), geenien (200 < n_genes), mitokondriaalisten geenien (percent_mito <20 %), ribosomaalisten geenien (percent_ribo <20 %) ja scrublet-pisteytyksen (scrublet_score <0,3) osalta. Yksittäiset ytimet suodatettiin lukumäärän (500 < n_counts <15 000), geenien (300 < n_genes <6 000), mitokondriaalisten geenien (percent_mito <5 %), ribosomaalisten geenien (percent_ribo <5 %) ja scrublet-pistemäärän (scrublet_score <0,3) osalta. Samoja suodatuskynnyksiä sovellettiin luurankolihaksiaineistoon.

Scanpy toolkit 1.576 in Python v.3..7 käytettiin jatkoanalyysien suorittamiseen, mukaan lukien normalisointi (normalize_per_cell: counts_per_cell_after = 10 000), log-muunnos (log1p), vaihtelevien geenien havaitseminen (highly_variable_genes), ei-toivottujen variaatiolähteiden poistaminen (regress_out: n_counts ja percent_mito), datan ominaispiirteiden skaalaus (scale: max_value = 10) ja PCA-analyysi (PCA) (pca: käyttäen erittäin vaihtelevia geenejä), kuten on kuvattu aiemmin77.

Eräkohdistus käyttäen syvää varioivaa autokooderia

Rakensimme globaalin moninaisuuden kohdistamalla kaikki aineistomme tietolähteet ja luovuttajat. Tämä tehtiin kolmivaiheisella menettelyllä: (1) Kukin lähde analysoitiin ja annotoitiin erikseen ja kohdistettiin vain luovuttajien osalta käyttämällä pericyte-avaruuden lineaarista regressiovaihetta ennen eräkohdistusta bbknn78:n avulla. Differentiaalisesti ilmentyneet geenit (DEG:t) laskettiin käyttämällä Wilcoxonin rank-summatestiä Bonferroni-Hochberg-sovituksella, joka on toteutettu Scanpy-kehyksessä. (2) Kunkin klusterin merkitsemiseen käytimme integroivaa lähestymistapaa etsimällä merkittävimmät DEG:t (P < 1 × 10-5), joiden logFC >1 oli ToppFun79- ja EnrichR80-tietokannoista. Merkittävät osumat polkuihin, transkriptionaaliseen säätelyyn ja biologisiin prosesseihin priorisoitiin tietyn klusterin merkitsemistä varten. Kukin solukompartimentti merkittiin adata.obs-slotin alle lähdekohtaisten solutilojen ryhmittelyn jälkeen. (3) Kaikki lähteet yhdistettiin yhdeksi AnnData-objektiksi merkinnän adata.obs alle. Erät linjattiin käyttämällä scGen-variaatioautokooderin81 batch_correction-funktiota. Ensin kohdistetaan adata.obs käyttäen adata.obs:ää ankkurina. Seuraavaksi kohdistettiin adata.obs:lle käyttäen adata.obs:ää ankkurina. Kutakin eräkohtaista kohdistuskierrosta ajettiin 50 epookin ajan.

Manifoldit adiposyyttien, verisuonten ja immuunijärjestelmän sydänpopulaatioille sekä luurankolihasanalyysille luotiin tällä menetelmällä, ja klusterointitarkkuus arvioitiin SCCAF:lla82 (Extended Data Fig. 12d).

DEG:t

Kunkin solukompartimentin alapopulaatioiden annotoinnin helpottamiseksi laskimme DEG:t käyttämällä Wilcoxonin rank-summatestiä, joka on toteutettu Scanpy-työnkulussa ja jota suositellaan viimeaikaisissa vertailututkimuksissa83. Geenin katsottiin olevan differentiaalisesti ekspressoitunut, jos sen log2-muunnettu kertainen muutos oli > 1 ja P < 1 × 10-5, ellei analyysiosassa toisin mainita.

Solujen ja solujen väliset vuorovaikutukset

Tutkittujen populaatioiden ekspressiomatriisit vietiin AnnDatasta yhdessä metatietotaulukon kanssa, joka sisälsi solun viivakoodit indekseinä. Tämän jälkeen ajettiin CellPhoneDB seuraavasti: cellphonedb method statistical_analysis meta.tsv counts.tsv-counts-data = gene_name-threads = 60. CellPhoneDB:n raa’at ennusteet suodatettiin poistamalla ne vuorovaikutukset, joiden P > 1,0 × 10-5. Merkitsevät parit toimitettiin sitten geenijoukon rikastumisanalyysiä varten ReactomeDB:hen, enrichR:ään ja ToppFuniin funktionaalista luokittelua varten. Verisuonisoluista otettiin satunnaisesti osanäyte 39 000 soluun ennen analyysia, ja sydämen korjausryhmästä (eteis- ja kammiokardiomyosyytit, FB:t ja immuunisolut) otettiin satunnaisesti osanäyte 69 295 soluun ennen analyysia.

Geeniekspression visualisointi 10X Genomicsin Visium-datasta

Käsittelimme 10X Genomicsin (https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.0.0/V1_Human_Heart) julkisesti saatavilla olevat vasemman kammion sydänlihaksen Visium-datan käyttäen Scanpy v.1:tä..5-työnkulkua, joka on mukautettu 10X Genomicsin Visium-datan analysointiin (https://scanpy-tutorials.readthedocs.io/en/latest/spatial/basic-analysis.html). Lyhyesti sanottuna poistettiin kohdat, joissa oli alle 500 UMI:tä tai yli 20 000 UMI:tä ja alle 200 geeniä. Tiedot muunnettiin log-muunnoksella ja normalisoitiin ennen piirtämistä.

RNA:n nopeuden arviointi

Yksittäisten solujen ja CD45+-rikastettujen yksittäisten solujen RNA:n nopeuden laskemiseksi käytimme CellRangerin BAM-tulostiedostoa ja GENCODE v33 GTF-tiedostoa (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz) yhdessä velocyto84 CLI v.0.17.17:n kanssa luodaksemme kangaspuutiedoston, joka sisälsi splikoidun ja splikoimattoman RNA:n kvantifioinnin. Seuraavaksi rakensimme manifoldin, klusteroimme solut ja visualisoimme RNA:n nopeudet käyttämällä scVelo85:tä.

Etelä- ja kammiokardiomyosyyttien, FB:iden ja hermosolujen alipopulaatioanalyysit

Kaikki viivakoodit, jotka oli leimattu globaalissa objektissa kardiomyosyyteiksi, fibroblasteiksi ja hermosoluiksi, valikoituivat tarkempiin alipopulaatioanalyyseihin. Solupopulaatiokohtaisia lisäsuodatuskriteerejä sovellettiin ytimiin seuraavasti: kardiomyosyyttien lukumäärät (n_counts <12 500), geenit (n_genes <4 000), mitokondriaaliset geenit (percent_mito <1 %), ribosomaaliset geenit (percent_ribo <1 %) ja scrublet-pistemäärä (scrublet_score <0.25); FB mitokondriaaliset geenit (percent_mito <1%), ribosomaaliset geenit (percent_ribo <1%); hermosolujen geenit (n_genes <4000), mitokondriaaliset geenit (percent_mito <1%), ribosomaaliset geenit (percent_ribo <1%). Kokonais- ja CD45+-solut jätettiin pois eteis- ja kammiokardiomyosyyttien tietokokonaisuuksista, eivätkä ne vaikuttaneet osapopulaatioanalyysiin. FB- tai hermosolujen kokonais- ja CD45+-soluja ei suodatettu enempää. Kardiomyosyytit ja FB:t jaettiin edelleen kahteen ryhmään alkuperäalueen perusteella: (1) vasen ja oikea eteinen ja (2) vasen ja oikea kammio, kärkikammio ja kammioväliseinä.

Donorivaikutukset kohdistettiin edellä vaiheessa (1) kuvatulla tavalla. FB- ja hermosolujen osalta lähteet kohdistettiin edellä vaiheessa (3) kuvatulla tavalla. Leidenin klusterointi ja UMAP-visualisointi suoritettiin osapopulaatioiden tunnistamiseksi ja visualisoimiseksi86. Differentiaalisesti ilmentyneet geenit laskettiin Wilcoxonin rank-summatestillä. Geenit asetettiin paremmuusjärjestykseen pistemäärän mukaan.

Sydämen immuunipopulaatioiden ristikudosvertailu luurankolihaksen, munuaisten ja veren immuunipopulaatioiden kanssa

Keräsimme aikuisten munuaisten yhden solun transkriptomitiedot ref. 99 (https://www.kidneycellatlas.org/) ja subsetoimme kaikki heidän tutkimuksessaan raportoidut immuunisolut. SKM:ää varten valitsimme annotoidut immuunisolut yhdistetystä monistosta. Ihmisen verta varten käytimme 10X Genomicsin (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/3.0.0/pbmc_10k_v3) toimittamaa julkisesti saatavilla olevaa 10 000 yksittäisen PBMC-solun tietokokonaisuutta. Kuten aiemmin on kuvattu87 , koulutimme logistisen regressiomallin sydämen immuunisoluille käyttäen 80 prosenttia ekspressiotiedoista ja testasimme sen tarkkuutta lopuilla 20 prosentilla tuottaaksemme mallin, jonka tarkkuus oli 0,6862 (laajennetut tiedot Kuva 8f, lisätaulukko 16). Sovelsimme sitten tätä mallia ennustamaan analogisia sydämen immuunipopulaatioita aikuisten munuaisissa, SKM:ssä ja PBMC:ssä. Ennusteet, joiden todennäköisyys oli alle 0,8, suljettiin pois myöhemmistä vertailevista analyyseistä.

Gene Ontology -rikastumisanalyysi

Kammiokardiomyosyyttipopulaatiota varten käytimme R-pakettia gProfileR (https://cran.r-project.org/web/packages/gProfileR/index.html), jossa oli syöttötietona vCM4:n pistemäärältään rankattu geeniluettelo ja taustatietona kammiokardiomyosyyteissä ekspressoituneiden geenien joukko (ne geenit, joilla oli UMI-luku >1). Gene-ontologia-analyysin suorittamiseksi verisuonisoluille etsittiin 500 merkittävintä DEG:tä (P < 1 × 10-5), joiden log-muunnettu kertainen muutos oli > 1, Gene Ontologyn biologisten prosessien tietokantaa vastaan ToppFun79:n avulla (lisätaulukko 25). Viisi tärkeintä merkitsevästi rikastunutta termiä (q < 0,05) jokaisesta osapopulaatiosta valittiin ja piirrettiin lämpökartalle. Polkuanalyysin suorittamiseksi rasvasoluille etsittiin ToppFun79-polkutietokantojen avulla 500 parasta merkittävää DEG:tä (P < 1 × 10-5), joiden log-muunnettu kertainen muutos oli > 0,5 (täydentävä taulukko 26). Viisi tärkeintä merkitsevästi rikastunutta polkua (q < 0,05) kullekin osapopulaatiolle valittiin ja piirrettiin lämpökartalle.

Gene set score

Käytämme scanpy:ssä toteutettua score_genes-funktiota laskeaksemme Oncostatin M -polkuun osallistuvien geenien rikastumisen. Luettelo geeneistä kerättiin kirjallisuustutkimuksen88,89 perusteella. Geenijoukon rikastamista varten otettiin huomioon vain voimakkaasti ekspressoituneet geenit kohinan vähentämiseksi (yli 500 UMI:tä kaikissa soluissa). Sama analyysi suoritettiin sydämen immuunisolujen vertailemiseksi tutkimuksessamme aiempien tutkimusten havaintoihin, jotka koskevat sydämessä asuvia makrofageja51, hiiren kudosta uudelleenmuokkaavia makrofageja45 ja keltarauhasen linjaperäistä alkuperää90.

Statistiikka ja toistettavuus

Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen R-ohjelmistoa, v.3.6.1. Studentin t-testejä käytettiin solutyyppijakaumien vertailuun kussakin paikassa. P < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä. Lineaariset regressiomallit (korrelaatiot) saatiin käyttämällä R:n lineaarisen mallin funktiota (lm), joka arvioi lineaarisen suhteen tilastollisen todennäköisyyden (P-arvo). Moninkertaista testausta varten sovellettiin Bonferroni-korjausta.

Kuvissa esitetyt RNAscope-mikrokuvaukset ovat edustavia. Kuvissa 2g, 3c, h ja laajennetuissa tiedoissa kuvissa 3c (HAMP), laajennetuissa tiedoissa kuvassa 3e (CNN1) ja laajennetuissa tiedoissa kuvissa 4g, m, 6f esitetyt mikrokuvat toistettiin samanlaisin tuloksin kahdessa yksittäisessä kudosleikkeessä. Kuvissa 2h, 3f ja laajennetuissa tiedoissa kuvissa 3c (CNN1), laajennetuissa tiedoissa kuvassa 3e (PCDH7) ja laajennetuissa tiedoissa kuvissa 6e, h, 9d esitetyt mikrokuvat toistettiin samanlaisin tuloksin kolmessa yksittäisessä kudosleikkeessä. Kuvissa 1e, 2d, 3e ja laajennetuissa tiedoissa kuvissa 1f, 3c (FHL1) ja laajennetuissa tiedoissa kuvassa 6d esitetyt mikrokuvat toistettiin samanlaisin tuloksin neljässä yksittäisessä kudosleikkeessä. Kuvissa 2c ja laajennetuissa tiedoissa kuvassa 3c (PRELID2) ja laajennetuissa tiedoissa kuvissa 10e, 12a esitetyt mikrokuvat toistettiin samanlaisin tuloksin kuudesta tai useammasta yksittäisestä kudosleikkeestä. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit tehtiin kerran kutakin käytettyä näytettä kohden.

GWAS-rikastumisanalyysi

Lastasimme GWAS-yhteenvetotilastot laajasta cvdi:stä, EBI:n GWAS-katalogista ja GWAS-atlaksesta. Valitsimme piirteet, joiden GWAS oli hyvin tehokasta (n > 5 000 ja merkitsevien lokusten määrä > 10). GWAS-tietokannoista on yhteenveto lisätaulukossa 27. Proteiinia koodaavien geenien geeniekspressiotiedot kartoitettiin Entrez-geenitunnuksiin, ja näitä geenien annotaatioita käytettiin ihmisen genomikokoelmassa hg19/37. Käytimme vain ytimistä saatuja geeniekspressiotietoja. Toteutimme aiemmin kuvatun analyysin64 pythonilla ja R:llä. Log-muunnettuja lukumääriä (plus yksi pseudoluku) käytettiin keskimääräisten solutyyppikohtaisten ekspressioprofiilien laskemiseen. Suoritimme yksittäisiä magma-analyysejä kullekin solutyypille ja ehdollistimme aina oletusarvoiset geenitason kovariaatit (esimerkiksi geenin pituus) ja keskimääräisen geeniekspression kaikissa soluissa. Tämän jälkeen sovelsimme Benjamini-Hochberg-menetelmää ja valitsimme solutyypin ominaisuuksien assosiaatiot, joiden FDR < 10 %. Näille pareille tehtiin sitten ehdollinen analyysi aiemmin kuvatulla tavalla64 ”riippumattomien”, ”yhteisesti selitettyjen” ja ”osittain yhteisesti selitettyjen” assosiaatioparien määrittelemiseksi (lisätaulukko 28).

Hajautettujen solujen ja eristettyjen ytimien jakaumat

Erilaiset menettelyt eristettyjen ytimien ja hajautettujen solujen hankkimiseksi johtivat huomattavan erilaisiin solutyyppien jakaumiin (lisätaulukko 29, laajennettu aineisto Kuva 2). Erityisesti 30,1 % ja 49,2 % eristetyistä ytimistä oli peräisin eteis- ja kammioalueiden kardiomyosyyteistä, kun taas nämä solut olivat enimmäkseen poissuljettuja eristetyistä ja CD45-selektoiduista soluista tehdyistä valmisteista (Täydentävä taulukko 2).

Kardiomyosyytit poislukien eristetyistä ytimistä ja dispersoiduista soluista identifioitujen solutyyppien jakauma säilyi edelleen erilaisena (Täydentävä taulukko 30). Vaikka 59,0 % dispergoituneista soluista oli EY:tä, vain 15,7 % ytimistä oli peräisin EY:stä. Sitä vastoin 64,2 % ytimistä oli peräisin FB:stä (31,2 %) ja perisyyteistä (33,0 %), kun taas vain 17,1 % hajautetuista soluista oli FB:tä (2,3 %) ja perisyyteistä (14,8 %). Nämä erot saattavat heijastaa EY:n ytimien herkkyyttä eristysmenetelmille tai perisyyttien ja FB:iden vastustuskykyä solujen entsymaattiselle pilkkomiselle.

Huolimatta eroista solujakaumissa eristettyjen ytimien ja hajautettujen solujen välillä solulinjojen geeniekspressiiviset profiilit korreloivat keskenään kohtuullisen hyvin (r > 0,4 jokaiselle solutyypille). Solujen ja ytimien kaappaamien geenien yhteneväisyyden käsittelemiseksi vertasimme kuvassa 1c esitettyjen tärkeimpien solutyyppien merkkiaineiden ilmentymistä kolmessa lähteessä (laajennetut tiedot, kuva 1c). Koska ytimistä puuttuu sytoplasmista RNA:ta, tiettyjen geenien, erityisesti immuunigeenien NKG7 ja C1QA, ilmentyminen oli vähäisempää ytimissä kuin soluissa. Yleinen suuntaus merkkigeenien suhteen oli kuitenkin johdonmukainen kaikissa kolmessa lähteessä, ja samat geenit erottivat yksittäiset solutyypit toisistaan lähteestä riippumatta.

Vaskulaaristen solujen tarkempi analyysi

PC3_str sisälsi samankaltaisen osuuden soluja ja tumia, ja sen scrublet-pistemäärä oli alle käytetyn tiukan kynnysarvotason; tästä huolimatta geenien ja lukumäärien keskiarvo tässä ryppäässä oli keskimääräistä suurempi. Näin ollen tiukasta laatusuodatuksestamme huolimatta emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että tässä klusterissa saattaa olla dubletteja. EC10_CMC-like ja PC4_CMC-like ekspressoivat EC- tai pericyyttien geenejä yhdessä kardiomyosyyttien markkereiden kanssa, ja lisätutkimuksia tarvitaan sen ymmärtämiseksi, edustavatko ne aiemmin tuntemattomia solutiloja vai dubletteja.

Havainnot valtimo- ja laskimoperäisestä SMC:stä saavat tukea aiemmista tutkimuksista, jotka ennustavat, että valtimoperäiset SMC:t ovat supistumiskykyisempiä ja laskimoperäiset SMC:t ovat vähemmän erilaistuneita91.

EC3_cap rikastuu transkripteille, jotka koodaavat AP1:n komponentteja (JUN ja FOS), joka välittää useita EY:n kohtaloa koskevia päätöksiä, mukaan lukien vaste VEGF:lle, tulehdus- ja stressisignaaleille, ja ATF3:lle, joka on erilaisten signaalien indusoima adaptiivisen vasteen geeni92,93,94.

Luurankolihaksen karakterisointi

Keräsimme interkostaaliset luurankolihasnäytteet viideltä terveeltä henkilöltä, mukaan lukien yhdeltä luovuttajalta, jolla oli vastaavaa sydänkudosta, ja profiloimme 35 665 yksittäisen solun ja 39 597 yksittäisen ytimen transkriptomin. Analogisesti sydämeen, solujen ja tuman yhdistelmä mahdollisti tärkeimpien solulinjojen, kuten kardiomyosyyttien, fibroblastien, endoteelisolujen, sileiden lihassolujen, perisyyttien, myelooisten ja lymfaattisten immuunisolujen ja satelliittisolujen, talteenottamisen ja erottamisen (laajennetut tiedot, kuva 11a, b, lisätaulukko 31).

Luurankolihaksen verisuonisolujen tarkemmassa analyysissä tunnistettiin kymmenen erillistä populaatiota. Endoteelisoluissa näkyi viisi klusteria, jotka oli erotettu kunkin verisuonipohjan perusteella ja joiden allekirjoitukset olivat samanlaisia kuin sydämessä havaitut. EC_cap ilmentää VWF:ää ja RGCC:tä. Laskimoiden EC_ven ilmentää ACKR1:tä ja PLVAP:ia, kun taas valtimoiden EC_art ilmentää SEMA3G:tä ja HEY1:tä, mikä on linjassa sydämen aineistomme kanssa (laajennettu aineisto Kuva 11c, d, lisätaulukko 32).

Luustolihaksen ja sydänlihaksen verisuoni- ja stroomasolupopulaatioiden yleiset jakaumat olivat samankaltaisia, mukaan lukien EC:n valtimo- ja laskimo-ominaisuudet; luustolihaksessa esiintyi kuitenkin vain yksi plasmanestesoluklusteri (SMC-clusteria), mikä saattaa liittyä aineistokokonaisuuksiemme pienempään kokoon. Luurankolihaksessa EC_artin ja SMC:n ennustettuihin solu-soluvuorovaikutuksiin sisältyivät NOTCH1/4-JAG1 sekä JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH3, mutta ei JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH2, joka oli päätelty sydämessä (laajennetut tiedot Kuva 11e, f, lisätaulukko 33).

Sydämen immuunisolut

Logistisen regressiomallin avulla emme tunnistaneet sydämen IL17RA+-monosyyttien vastinetta SKM:ssä tai munuaisissa, mikä johtui mahdollisesti tämän populaation pienestä koosta.

Tunnistetut naivistiset T-solut (CD4+T_naivistiset) ekspressoivat CCR7:ää ja SELL:ää, mikä viittaa niiden naivistiseen ja kudoksessa residenssissä olevaan luonteeseen95. Muisti-T-solut (CD8+T_tem) ilmentivät BACH2:ta, STAT4:ää ja IL7R:ää, jotka liittyvät pitkäaikaiseen immuunimuistiin96,97. Luokittelimme lymfaattiset solut edelleen scNymin98 avulla ja koulutimme sen julkaistujen tietojen perusteella99,100. Tuloksena saatua mallia sovellettiin sydämen immuunisoluihin, ja niiden solujen, joiden ennustettu pistemäärä oli yli 0,8, oletettiin olevan todennäköisiä ehdokkaita uudelleenannotointiin. Tämän lähestymistavan avulla tunnistimme ehdokkaita plasman B-soluille (109), dendriittisille soluille (645), synnynnäisille lymfaattisille soluille (89), MAIT T-soluille (219), T-auttajasoluille (80), T-säätelysoluille (11), T-keskusmuistisoluille (103), γδ T-soluille (30) ja plasmosytoidisille dendriittisoluille (27). Nämä annotaatiot löytyvät sydänimmuuniobjektin annotaatioista merkinnällä ”scNym” osoitteessa www.heartcellatlas.org.

Raportointiyhteenveto

Lisätietoa tutkimussuunnittelusta on saatavilla Nature Research Reporting Summary -julkaisussa, joka on linkitetty tähän artikkeliin.