Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je forma sloupcové chromatografie, při které se směs vzorků nebo analytu v rozpouštědle (tzv. mobilní fáze) čerpá za vysokého tlaku přes kolonu s chromatografickým obalovým materiálem (stacionární fáze). Vzorek je přenášen pohyblivým proudem nosného plynu helia nebo dusíku. HPLC má schopnost oddělit a identifikovat sloučeniny, které jsou přítomny v jakémkoli vzorku, jenž může být rozpuštěn v kapalině ve stopových koncentracích již od částic na bilion. Díky této univerzálnosti se HPLC používá v řadě průmyslových a vědeckých aplikací, například ve farmacii, životním prostředí, kriminalistice a chemii.
Retenční doba vzorku se liší v závislosti na interakci mezi stacionární fází, analyzovanými molekulami a použitým rozpouštědlem nebo rozpouštědly. Jak vzorek prochází kolonou, interaguje mezi oběma fázemi různou rychlostí, především v důsledku rozdílné polarity analytů. Analyty, které mají nejmenší interakci se stacionární fází nebo největší interakci s mobilní fází, opustí kolonu rychleji.
Instrumentace:
Hlavní součásti systému HPLC zahrnují zásobník rozpouštědla nebo více zásobníků, vysokotlaké čerpadlo, kolonu, systém injektorů a detektor.
Detekční limit |
Doporučení pro plyn |
Doporučení pro regulátor |
| Propouštěcí plyn | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Helium 5.0 | BASELINE C106 series |
V zásobníku se nachází rozpouštědlo, které se označuje jako mobilní fáze, protože se pohybuje. V systému jsou obvykle minimálně dva zásobníky, přičemž každý z nich pojme až 1000 cm3 rozpouštědla a obvykle je vybaven difuzorem plynu, kterým lze probublávat helium. K vytvoření určitého průtoku mobilní fáze se používá čerpadlo. Ačkoli je stále možné vzorky vstřikovat ručně, většina HPLC je nyní plně automatizovaná a řízená počítačem. Injektor nebo automatický vzorkovač zavádí rozpouštědlo do proudu fáze, který přenáší vzorek do vysokotlaké (až 400 barů) kolony, která obsahuje specifický obalový materiál potřebný k provedení separace. Obalový materiál se označuje jako stacionární fáze, protože je držen na místě hardwarem kolony.
Detektor je potřebný k tomu, aby bylo možné vidět pásy separovaných sloučenin při jejich eluci z vysokotlaké kolony. Informace jsou z detektoru odesílány do počítače, který vytváří chromatogram. Mobilní fáze vystupuje z detektoru a je podle potřeby buď odeslána do odpadu, nebo shromážděna.
Rozprašování helia je účinnou metodou odplyňování mobilní fáze, aby se zabránilo nestabilním základním liniím způsobeným rozpuštěným vzduchem. Dusík se používá jako nebulizační plyn v odpařovacím detektoru rozptylu světla (ELSD), kde se rozpouštědlo odpařuje ze vzorku a při měření zůstává mlha.
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – další typy HPLC
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (uHPLC):
Když standardní HPLC obvykle používá kolony s částicemi o velikosti 3 až 5 µm a tlaky kolem 400 barů, uHPLC používá speciálně navržené kolony s částicemi o velikosti až 1,7 µm při tlacích přesahujících 1000 barů. Hlavní výhodou uHPLC je rychlost. Tyto systémy jsou rychlejší, citlivější a jsou závislé na menších objemech organických rozpouštědel než standardní HPLC, což vede k možnosti zpracovat více vzorků za kratší dobu. Pokud jsou však systémy provozovány při typických tlacích vyšších než 800 barů, kolony stárnou nebo rychleji degradují. Pro jednotky uHPLC je vyvíjena novější technologie, která využívá částice kolon o velikosti 1 µm a tlakový potenciál až 6 800 bar.
uHPLC je také známá jako UPLCTM, což je ochranná známka společnosti Waters Corporation.
Rychlá proteinová kapalinová chromatografie (FPLC):
FPLC je systém podobný vysokoúčinné kapalinové chromatografii, který se používá k separaci nebo čištění proteinů a dalších biomolekul ze složitých směsí. Hlavním rozdílem mezi FPLC a HPLC je standardní pracovní tlak. Kolony FPLC lze používat pouze do maximálního tlaku 3-5 MPa. Pokud lze tlak HPLC omezit, lze téměř každou kolonu FPLC použít i v systému HPLC
.