RuBisCO

RuBisCO je jedním z mnoha enzymů v Calvinově cyklu. Když Rubisco usnadňuje atak CO2 na uhlík C2 RuBP a následné štěpení vazby mezi uhlíkem C3 a C2, vznikají 2 molekuly glycerát-3-fosfátu. Přeměna zahrnuje tyto kroky: enolizaci, karboxylaci, hydrataci, štěpení vazby C-C a protonizaci.

SubstrátyEdit

Substráty pro RuBisCO jsou ribulosa-1,5-bisfosfát a oxid uhličitý (odlišný od „aktivačního“ oxidu uhličitého). RuBisCO také katalyzuje reakci ribulosa-1,5-bisfosfátu a molekulárního kyslíku (O
2) namísto oxidu uhličitého (CO
2). rozlišení mezi substráty CO2 a O2 se připisuje rozdílným interakcím kvadrupólových momentů substrátu a vysokému gradientu elektrostatického pole. Tento gradient je vytvořen dimerní formou minimálně aktivního RuBisCO, který se svými dvěma složkami poskytuje kombinaci opačně nabitých domén potřebných pro interakci enzymu s O2 a CO
2. Tyto podmínky pomáhají vysvětlit nízkou rychlost obratu zjištěnou u RuBisCO: Aby se zvýšila síla elektrického pole potřebná pro dostatečnou interakci s kvadrupólovými momenty substrátů, musí být C- a N- terminální segmenty enzymu uzavřeny, což umožňuje izolaci aktivního místa od rozpouštědla a snížení dielektrické konstanty. Tato izolace má značné entropické náklady a vede k nízké rychlosti obratu.

Vazba RuBPEdit

Karbamylace ε-amino skupiny Lys201 je stabilizována koordinací s Mg2+. Tato reakce zahrnuje vazbu karboxylátových konců Asp203 a Glu204 na ion Mg2+. Substrát RuBP váže Mg2+ a vytěsňuje dva ze tří aquo ligandů.

EnolisationEdit

Enolisation of RuBP is the conversion of the keto tautomer of RuBP to an enediol(ate). Enolizace je zahájena deprotonací na C3. O enzymové bázi v tomto kroku se vedou diskuse, ale podle sterických omezení pozorovaných v krystalových strukturách je nejpravděpodobnějším kandidátem Lys201. Konkrétně karbamátový kyslík na Lys201, který není koordinován s iontem Mg, deprotonuje uhlík C3 RuBP za vzniku 2,3-endiolátu.

KarboxylaceEdit

Karboxylace 2,3-endiolátu vede ke vzniku meziproduktu 3-keto-2′-karboxyarabinitol-1,5-bisfosfátu a Lys334 je umístěn tak, aby usnadnil přidání substrátu CO2, protože nahrazuje třetí molekulu vody koordinovanou s Mg2+ a přidává se přímo k enediolu. Při tomto procesu nevzniká žádný Michaelisův komplex. Hydratace tohoto ketonu vede ke vzniku další hydroxyskupiny na C3, čímž vzniká meziprodukt gem-diol. Karboxylace a hydratace byly navrženy buď jako jeden sladěný krok, nebo jako dva postupné kroky. Souhlasný mechanismus je podpořen blízkostí molekuly vody k C3 RuBP ve více krystalových strukturách. Ve struktuře špenátu mají ostatní zbytky dobrou pozici pro pomoc při hydratačním kroku, protože jsou ve vzdálenosti vodíkové vazby od molekuly vody.

Štěpení vazby C-CEdit

Prostředek gem-diol se štěpí na vazbě C2-C3 za vzniku jedné molekuly glycerát-3-fosfátu a záporně nabitého karboxylátu. Stereospecifickou protonací C2 tohoto karbanionu vzniká další molekula glycerát-3-fosfátu. Předpokládá se, že tento krok usnadňuje Lys175 nebo případně karbamylovaný Lys201.

ProduktyEdit

Pokud je substrátem oxid uhličitý, produktem karboxylázové reakce je nestabilní šestiuhlíkatý fosforylovaný meziprodukt známý jako 3-keto-2-karboxyarabinitol-1,5-bisfosfát, který se rychle rozpadá na dvě molekuly glycerát-3-fosfátu. Z 3-fosfoglycerátu lze vyrobit větší molekuly, například glukosu.

Boční aktivity Rubisco mohou vést k neužitečným nebo inhibičním vedlejším produktům; jedním z takových produktů je xylulosa-1,5-bisfosfát, který inhibuje aktivitu Rubisco.

Pokud je substrátem molekulární kyslík, produkty reakce oxygenasy jsou fosfoglykolát a 3-fosfoglycerát. Fosfoglykolát je recyklován prostřednictvím sledu reakcí nazývaných fotorespirace, na nichž se podílejí enzymy a cytochromy umístěné v mitochondriích a peroxizomech (jedná se o případ opravy metabolitů). Při tomto procesu se dvě molekuly fosfoglykolátu přemění na jednu molekulu oxidu uhličitého a jednu molekulu 3-fosfoglycerátu, které mohou znovu vstoupit do Calvinova cyklu. Část fosfoglykolátu vstupujícího do této dráhy si rostliny mohou ponechat k výrobě dalších molekul, například glycinu. Při okolních hladinách oxidu uhličitého a kyslíku je poměr těchto reakcí přibližně 4:1, což vede k čisté fixaci oxidu uhličitého pouze 3,5. Neschopnost enzymu zabránit reakci s kyslíkem tedy značně snižuje fotosyntetickou kapacitu mnoha rostlin. Některé rostliny, mnohé řasy a fotosyntetické bakterie překonaly toto omezení tím, že vymyslely způsoby, jak zvýšit koncentraci oxidu uhličitého v okolí enzymu, včetně C4 fixace uhlíku, metabolismu krassulových kyselin a použití pyrenoidu.

Rychlost enzymatické aktivityUpravit

Některé enzymy mohou provádět tisíce chemických reakcí každou sekundu. RuBisCO je však pomalý, každou sekundu fixuje pouze 3-10 molekul oxidu uhličitého na molekulu enzymu. Reakce katalyzovaná RuBisCO je tedy hlavním faktorem omezujícím rychlost Calvinova cyklu během dne. Nicméně za většiny podmínek, a pokud světlo jinak neomezuje fotosyntézu, reaguje rychlost RuBisCO pozitivně na zvyšující se koncentraci oxidu uhličitého.

RuBisCO je obvykle aktivní pouze během dne, protože ribulosa 1,5-bisfosfát se ve tmě neobnovuje. To je způsobeno regulací několika dalších enzymů v Calvinově cyklu. Kromě toho je aktivita RuBisCO koordinována s aktivitou ostatních enzymů Kalvínova cyklu několika dalšími způsoby:

IontyEdit

Při osvětlení chloroplastů se pH stromatu zvýší ze 7,0 na 8,0 díky protonovému (vodíkovému iontu, H+
) gradientu vytvořenému přes thylakoidní membránu. Pohyb protonů do tylakoidů je řízen světlem a má zásadní význam pro syntézu ATP v chloroplastech (Další informace: Fotosyntetické reakční centrum; Reakce závislé na světle). Aby se vyrovnal iontový potenciál přes membránu, pohybují se v reakci na to z tylakoidů ionty hořčíku (Mg2+
), čímž se zvyšuje koncentrace hořčíku ve stromatu chloroplastů. RuBisCO má vysoké optimální pH (může být >9,0, v závislosti na koncentraci hořečnatých iontů), a proto se „aktivuje“ zavedením oxidu uhličitého a hořčíku do aktivních míst, jak je popsáno výše.

RuBisCO activaseEdit

U rostlin a některých řas je k rychlé tvorbě kritického karbamátu v aktivním místě RuBisCO zapotřebí další enzym, RuBisCO activase (Rca, GO:0046863, P10896). To je nutné, protože ribulosa 1,5-bisfosfát (RuBP) se silněji váže na aktivní místa RuBisCO, když je přítomen nadbytek karbamátu, což brání tomu, aby procesy postupovaly vpřed. Na světle podporuje aktiváza RuBisCO uvolnění inhibičního (nebo – podle některých názorů – zásobního) RuBP z katalytických míst RuBisCO. Aktiváza je také nutná u některých rostlin (např. tabáku a mnoha fazolí), protože ve tmě je RuBisCO inhibován (nebo chráněn před hydrolýzou) kompetitivním inhibitorem syntetizovaným těmito rostlinami, substrátovým analogem 2-karboxy-D-arabitinol-1-fosfátu (CA1P). CA1P se pevně váže na aktivní místo karbamylovaného RuBisCO a inhibuje katalytickou aktivitu v ještě větší míře. Bylo také prokázáno, že CA1P udržuje RuBisCO v konformaci, která je chráněna před proteolýzou. Na světle aktiváza RuBisCO rovněž podporuje uvolňování CA1P z katalytických míst. Po uvolnění CA1P z RuBisCO je rychle převeden na neinhibiční formu světlem aktivovanou CA1P-fosfatázou. I bez těchto silných inhibitorů se jednou za několik set reakcí nedokončí normální reakce s oxidem uhličitým nebo kyslíkem; v aktivním místě se stále tvoří další inhibiční analogy substrátu. Aktiváza RuBisCO může opět podpořit uvolnění těchto analogů z katalytických míst a udržet enzym v katalyticky aktivní formě. Při vysokých teplotách však RuBisCO activase agreguje a nemůže již RuBisCO aktivovat. To přispívá ke snížené karboxylační kapacitě pozorované během tepelného stresu.

Podle ATP/ADP a stavu redukce/oxidace stromatu prostřednictvím aktivázyEdit

Odstranění inhibičních RuBP, CA1P a dalších inhibičních substrátových analogů aktivázou vyžaduje spotřebu ATP. Tato reakce je inhibována přítomností ADP, a proto aktivita aktivázy závisí na poměru těchto sloučenin ve stromatu chloroplastu. U většiny rostlin je navíc citlivost aktivázy na poměr ATP/ADP modifikována redukčním/oxidačním (redoxním) stavem stromatu prostřednictvím dalšího malého regulačního proteinu, thioredoxinu. Tímto způsobem lze aktivitu aktivázy a aktivační stav RuBisCO modulovat v závislosti na intenzitě světla, a tím i na rychlosti tvorby substrátu ribulosa 1,5-bisfosfátu.

FosfátemEdit

U sinic se na koordinované regulaci fotosyntézy podílí také anorganický fosfát (Pi): Pi se váže na aktivní místo RuBisCO a na další místo na velkém řetězci, kde může ovlivňovat přechody mezi aktivovanou a méně aktivní konformací enzymu. Tímto způsobem by aktivace bakteriální RuBisCO mohla být obzvláště citlivá na hladinu Pi, což by mohlo způsobit, že by se chovala podobně jako aktivace RuBisCO u vyšších rostlin.

Oxidem uhličitýmEdit

Protože oxid uhličitý a kyslík soutěží v aktivním místě RuBisCO, fixaci uhlíku RuBisCO lze zvýšit zvýšením hladiny oxidu uhličitého v kompartmentu obsahujícím RuBisCO (stroma chloroplastu). Během evoluce rostlin se několikrát vyvinuly mechanismy pro zvýšení hladiny oxidu uhličitého ve stromatu (viz C4 fixace uhlíku). Využití kyslíku jako substrátu se jeví jako záhadný proces, protože se zdá, že dochází k vyhození zachycené energie. Může se však jednat o mechanismus, který zabraňuje přetížení sacharidy v období vysokého světelného toku. Tato slabina enzymu je příčinou fotorespirace, takže zdravé listy na jasném světle mohou mít nulovou čistou fixaci uhlíku, když se poměr O
2 a CO
2 dostupný pro RuBisCO příliš posune směrem ke kyslíku. Tento jev je primárně závislý na teplotě: Vysoké teploty mohou snížit koncentraci CO
2 rozpuštěného ve vlhkosti listových pletiv. Tento jev souvisí také s vodním stresem: Vzhledem k tomu, že listy rostlin jsou evaporačně ochlazovány, způsobuje omezený přísun vody vysoké teploty listů. Rostliny C4 používají zpočátku enzym PEP karboxylázu, který má vyšší afinitu k CO
2. Při tomto procesu vzniká nejprve čtyřuhlíkatá mezisloučenina, která je přemístěna do místa C3 fotosyntézy a poté de-karboxylována, čímž se uvolní CO
2 a zvýší se koncentrace CO
2, odtud název C4 rostliny.

Rostliny s kyselým metabolismem (CAM) mají přes den zavřené žaludky, což šetří vodu, ale zabraňuje probíhání reakcí nezávislých na světle (tzv. Calvinův cyklus), protože tyto reakce vyžadují, aby CO
2 procházel výměnou plynů těmito otvory. Odpařování přes horní stranu listu brání vrstva vosku

.