Replikace a rekombinace DNA

„I když jsou fakta ze své podstaty méně uspokojivá než intelektuální závěry z nich vyvozené, jejich význam by neměl být nikdy zpochybňován.“ James D. Watson, 2002.

DNA nese veškerou genetickou informaci pro život. Jedna nesmírně dlouhá molekula DNA tvoří každý z chromozomů organismu, u člověka je to 23 chromozomů. Základní živou jednotkou je jediná buňka. Z buňky vzniká mnoho dalších buněk prostřednictvím sériového opakování procesu známého jako buněčné dělení. Před každým dělením musí být vytvořeny nové kopie každé z mnoha molekul, které tvoří buňku, včetně duplikace všech molekul DNA. Replikace DNA je název pro tento proces duplikace, který umožňuje předání genetické informace organismu – jeho genů – dvěma dceřiným buňkám vzniklým při dělení buňky. Jen o něco méně zásadní pro život je proces, který vyžaduje dynamickou akrobacii DNA, nazývaný homologní rekombinace DNA, při níž se přehazují geny na chromozomech. V reakcích úzce spojených s replikací DNA rekombinační mechanismus také opravuje poškození, k nimž nevyhnutelně dochází na dlouhých, křehkých molekulách DNA uvnitř buněk (viz Friedbergův článek v tomto čísle, strana 436).

Model dvojité šroubovice DNA1 navržený Jamesem Watsonem a Francisem Crickem je založen na dvou párových vláknech DNA, která jsou komplementární ve své nukleotidové sekvenci. Tento model měl pozoruhodné důsledky pro procesy replikace DNA a rekombinace DNA. Před rokem 1953 neexistoval žádný smysluplný způsob, jak o molekulárních mechanismech těchto dvou ústředních genetických procesů byť jen spekulovat. Ale návrh, že každý nukleotid v jednom vlákně DNA je pevně spárován se svým komplementárním nukleotidem na opačném vlákně – buď adenin (A) s thyminem (T), nebo guanin (G) s cytosinem (C) – znamenal, že jakákoli část nukleotidové sekvence může fungovat jako přímá předloha pro odpovídající část druhého vlákna. V důsledku toho může být jakákoli část sekvence použita buď k vytvoření, nebo k rozpoznání své partnerské nukleotidové sekvence – což jsou dvě funkce, které jsou ústřední pro replikaci DNA, respektive rekombinaci DNA.

V tomto přehledu se zabývám tím, jak objev struktury DNA před půl stoletím otevřel nové možnosti pro pochopení procesů replikace a rekombinace DNA. Zdůrazním také, jak s tím, jak se v průběhu let zvýšilo naše porozumění složitým biologickým molekulám a jejich interakcím, došlo k zásadním změnám v pohledu biologů na chemii života.

Strukturní vlastnosti DNA

Výzkum, který bezprostředně následoval po objevu dvojité šroubovice, se zaměřil především na pochopení strukturních vlastností molekuly. DNA specifikuje RNA prostřednictvím procesu transkripce genů a molekuly RNA zase specifikují všechny bílkoviny buňky. To je „hlavní dogma“ přenosu genetické informace2. Jakékoli čtení genetické informace – ať už při replikaci DNA, nebo při přepisu genů – vyžaduje přístup k sekvenci bází ukrytých uvnitř dvojité šroubovice. Oddělení vláken DNA je proto pro funkci DNA klíčové. Proto Watsonův-Crickův model vedl vědce k hledání podmínek, které by narušily vodíkové vazby spojující komplementární páry bází tak, aby došlo k oddělení obou vláken dvojité šroubovice DNA.

Fyzikální chemici zjistili, že zahřátí roztoku DNA na teplotu blízkou varu (100 °C) nebo jeho vystavení extrémním hodnotám pH způsobí oddělení vláken – změnu označovanou jako „denaturace DNA“. Takzvaná „teplota tání“ (neboli Tm) úseku DNA závisí na složení nukleotidů: DNA s větším podílem párů bází G-C vykazují vyšší Tm kvůli třem vodíkovým vazbám, které podle předpovědi Watsona a Cricka drží pár bází G-C pohromadě, zatímco u páru bází A-T jsou to pouze dvě. Při fyziologických koncentracích solí je Tm savčí DNA téměř 90 °C, což je dáno zvláštním složením jejích párů bází (47 % G-C a 53 % A-T)3.

Původně se zdálo nemyslitelné, že by se vlákno DNA po oddělení od svého komplementárního partnera mohlo opět spojit do dvojité šroubovice. Ve složité směsi molekul DNA by takový výkon vyžadoval nalezení jediné shodné sekvence mezi miliony při náhodných srážkách s jinými sekvencemi a následné rychlé převinutí s novým partnerským vláknem. Dramatický objev tohoto neočekávaného jevu4 , nazývaného „renaturace DNA“, objasnil, jak mohou být sekvence rekombinací DNA přeskupovány. A také poskytl zásadní prostředek, kterým lze s DNA manipulovat v laboratoři. Žíhání komplementárních nukleotidových sekvencí, proces nazývaný hybridizace, tvoří základ několika DNA technologií, které pomohly nastartovat biotechnologický průmysl a moderní genomiku. Patří k nim klonování genů, sekvenování genomu a kopírování DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (viz článek Hood a Galas na straně 444).

Uspořádání molekul DNA v chromozomech představovalo pro vědce další záhadu: dlouhá, tenká molekula by byla velmi citlivá na zlomy vyvolané střihem a bylo těžké si představit, že by savčí chromozom mohl obsahovat pouze jednu molekulu DNA. To by vyžadovalo, aby byl typický chromozom tvořen souvislou šroubovicí DNA dlouhou více než 100 milionů párů nukleotidů – masivní molekulou o hmotnosti více než 100 miliard daltonů, jejíž vzdálenost od konce ke konci přesahuje 3 cm. Jak by bylo možné takovou obří molekulu ochránit před náhodnou fragmentací v buňce o průměru pouhých mikrometrů a zároveň ji udržet uspořádanou pro efektivní čtení genů a další genetické funkce?

Ve světě biologie neexistoval pro takové obří molekuly žádný precedens. Na počátku 60. let 20. století však autoradiografické studie odhalily, že chromozom bakterie Escherichia coli je ve skutečnosti jediná molekula DNA o délce více než 3 miliony párů nukleotidů5. A když – o více než deset let později – inovativní fyzikální techniky prokázaly, že jediná obrovská molekula DNA tvoří základ každého savčího chromozomu6, vědci výsledek přivítali jen s malým překvapením.

Replikační vidlice DNA

Jak se obrovsky dlouhá dvouvláknová molekula DNA, která tvoří chromozom, přesně kopíruje, aby při každém dělení buňky vznikl druhý identický chromozom? Templátový model replikace DNA, navržený Watsonem a Crickem v roce 1953 (cit.7 ), získal všeobecné uznání po dvou objevech na konci 50. let. Jedním z nich byl elegantní experiment s bakteriální DNA značenou hustotou, který potvrdil předpovězené schéma templát-anti-templát8. Druhým byl objev enzymu zvaného DNA polymeráza, který využívá jedno vlákno DNA jako templát k syntéze nového komplementárního vlákna9. Čtyři deoxyribonukleosidtrifosfátové nukleotidy – dATP, dTTP, dGTP a dCTP – jsou prekurzory nového dceřiného vlákna DNA, přičemž každý nukleotid je vybrán párováním se svým komplementárním nukleotidem (T, A, C nebo G) na rodičovském templátovém vlákně. Bylo prokázáno, že DNA polymeráza používá tyto trifosfáty k postupnému přidávání nukleotidů na 3′ konec nově syntetizované molekuly DNA, čímž katalyzuje růst řetězce DNA v chemickém směru od 5′ k 3′.

Ačkoli syntézu krátkých úseků sekvence DNA na jednořetězcové předloze bylo možné demonstrovat ve zkumavce, způsob replikace obrovské, stočené dvouřetězcové molekuly DNA byl záhadou. Uvnitř buňky bylo pozorováno, že replikace DNA probíhá ve struktuře ve tvaru písmene Y, nazývané „replikační vidlička“, která se stabilně pohybuje podél rodičovské šroubovice DNA a za ní roztáčí dvě dceřiné šroubovice DNA (dvě ramena písmene „Y“)5 . Jak předpověděli Watson a Crick, obě vlákna dvojité šroubovice probíhají v opačných chemických směrech. Proto se při pohybu replikační vidlice může DNA polymeráza pohybovat nepřetržitě pouze podél jednoho ramene Y – ramene, na kterém se prodlužuje nové dceřiné vlákno v chemickém směru 5′ až 3′. Na druhém rameni by se nové dceřiné vlákno muselo vytvářet v opačném, 3′ až 5′ chemickém směru (obr. 1a). Zatímco tedy hlavní předpovědi Watsona a Cricka byly na konci prvního desetiletí výzkumu, které následovalo po jejich přelomovém objevu, potvrzeny, detaily procesu replikace DNA zůstávaly záhadou.

Rekonstrukce replikace

Záhada byla vyřešena v průběhu následujících dvou desetiletí, tedy v období, kdy byly identifikovány proteiny, které představují hlavní aktéry procesu replikace DNA. Vědci používali různé experimentální přístupy k identifikaci stále rostoucího souboru genových produktů, o nichž se předpokládalo, že jsou pro replikaci DNA rozhodující. Byly například identifikovány mutantní organismy, u nichž byla replikace DNA defektní, a genetické techniky pak mohly být použity k identifikaci specifických souborů genů potřebných pro proces replikace10,11,12. Pomocí proteinů specifikovaných těmito geny byly vytvořeny „bezbuněčné“ systémy, v nichž byl proces znovu vytvořen in vitro za použití purifikovaných složek. Zpočátku byly proteiny testovány v „částečné replikační reakci“, kde byla přítomna pouze podskupina proteinových mechanismů potřebných pro úplný proces replikace a templát DNA byl poskytnut v jednořetězcové formě13. Nové proteiny, které byly identifikovány, byly přidávány po jednom nebo v kombinaci, aby se otestoval jejich vliv na katalytickou aktivitu DNA polymerázy. Další pokroky v pochopení replikace pak závisely na vytvoření složitějších systémů in vitro, v nichž bylo možné díky přidání většího souboru purifikovaných proteinů nakonec replikovat dvouřetězcovou DNA14,15.

Dnes se téměř všechny procesy uvnitř buněk – od replikace DNA a rekombinace až po transport membránových vezikul – studují v systému in vitro rekonstruovaném z purifikovaných komponent. Ačkoli je vytvoření takových systémů pracné, umožňují přesnou kontrolu koncentrace i detailní struktury jednotlivých složek. Navíc se eliminací proteinů, které tyto další reakce katalyzují, zabrání „šumu“ v přirozeném systému způsobenému vedlejšími reakcemi – protože většina molekul v buňce se účastní více než jednoho typu reakce. V podstatě lze malou část buňky znovu vytvořit jako ohraničený soubor chemických reakcí, takže je plně přístupná přesnému studiu pomocí všech nástrojů fyziky a chemie.

V roce 1980 umožnily multiproteinové systémy in vitro podrobnou charakterizaci replikačního aparátu a vyřešily problém, jak se DNA syntetizuje na obou stranách replikační vidličky (obr. 1b). Jedno dceřiné vlákno DNA je kontinuálně syntetizováno molekulou DNA polymerázy pohybující se po „vedoucím vlákně“, zatímco druhá molekula DNA polymerázy na „opožděném vlákně“ vytváří dlouhou řadu fragmentů (tzv. Okazakiho fragmenty)16 , které jsou spojeny enzymem DNA ligázou a vytvářejí souvislé vlákno DNA. Jak se dalo očekávat, existuje rozdíl v proteinech potřebných pro syntézu vedoucího a opožděného vlákna DNA (viz rámeček 1). Pozoruhodné je, že se podařilo prokázat, že replikační vidličky vytvořené v těchto umělých systémech se pohybují stejně rychle jako vidličky uvnitř buněk (500 až 1 000 nukleotidů za sekundu) a templát DNA se kopíruje s neuvěřitelně vysokou věrností15.

Když bylo zjištěno, že na replikační vidličce funguje stále více proteinů, bylo možné porovnávat replikační mechanismy různých organismů. Studie replikačního aparátu u virů, bakterií a eukaryot odhalily, že replikační vidličky v každém organismu řídí společný soubor proteinových aktivit (rámeček 1). Každý systém se skládá z: molekuly polymerázy vedoucího a opožďujícího se řetězce DNA; primázy DNA, která vytváří primery RNA, jimiž začíná každý Okazakiho fragment; proteinů vázajících jednořetězcovou DNA, které obalují templátovou DNA a udržují ji na místě; helikázy DNA, která odvíjí dvojitou šroubovici; a dalších akcesorních proteinů polymerázy, které poutají polymerázy k sobě navzájem a k templátu DNA. Jak se postupuje od jednoduchého viru ke složitějším organismům, jako jsou kvasinky nebo savci, počet podjednotek, které tvoří jednotlivé typy proteinové aktivity, má tendenci se zvyšovat. Například celkový počet polypeptidových podjednotek, které tvoří jádro replikačního aparátu, se zvyšuje ze čtyř, resp. sedmi u bakteriofágů T7 a T4 na 13 u bakterie E. coli. A u kvasinek Saccharomyces cerevisiae a savců se rozšiřuje na nejméně 27. Jak se tedy vyvíjely organismy s většími genomy, do replikačního aparátu přibývaly nové proteinové podjednotky, aniž by se změnily základní mechanismy15,18,19,20.

Zatímco práce, kterou jsem popsal v oblasti replikace DNA, postupovala, jiné skupiny vědců vytvářely systémy in vitro, v nichž bylo možné rekonstruovat homologní rekombinaci DNA. Ústředním hráčem v těchto reakcích byl protein typu RecA17 , pojmenovaný podle bakteriálního mutanta defektního v rekombinaci, který vedl k jeho objevu (rámeček 2).

Stroje na výrobu bílkovin

Stejně jako všechny ostatní aspekty buněčné biochemie se i replikační aparát DNA vyvíjel po miliardy let metodou „pokus-omyl“, tj. náhodnou variací a následným přírodním výběrem. Postupem času mohl být do směsice proteinů aktivních na replikační vidličce přidáván jeden protein za druhým, pravděpodobně proto, že nový protein zvyšoval rychlost, kontrolu nebo přesnost celého replikačního procesu. Kromě toho byla struktura každého proteinu dolaďována mutacemi, které měnily jeho aminokyselinovou sekvenci tak, aby se zvýšila jeho účinnost. Konečným výsledkem tohoto neobvyklého inženýrského procesu jsou replikační systémy, které dnes pozorujeme u různých organismů. Lze tedy očekávat, že mechanismus replikace DNA bude do značné míry závislý na náhodných událostech v minulosti. Vybrala však evoluce to, co funguje, bez potřeby elegance?“

Prvních 30 let po Watsonově a Crickově objevu se zdálo, že většina vědců zastává názor, že buněčné procesy mohou být nedbalé. Tento názor byl podporován poznatky o obrovské rychlosti pohybů na molekulární úrovni (například bylo známo, že typický protein se srazí s druhou molekulou přítomnou v koncentraci 1 mM asi 106krát za sekundu). Původně se mělo za to, že rychlost molekulárních pohybů umožňuje, aby proces, jako je replikace DNA, probíhal bez jakékoliv organizace zúčastněných bílkovin v trojrozměrném prostoru.

V současné době molekulární biologové naopak uznávají, že evoluce selektovala vysoce uspořádané systémy. Tak například nejenže jsou části replikačního aparátu drženy pohromadě v přesných zarovnáních, aby se optimalizovaly jejich vzájemné interakce, ale k vytváření koordinovaných pohybů se využívají energeticky řízené změny konformací proteinů. To zajišťuje, že každý z po sobě jdoucích kroků složitého procesu, jako je replikace DNA, je úzce koordinován s dalším krokem. Výsledkem je sestava, kterou lze považovat za „proteinový stroj“. Například molekula polymerázy DNA na opožděné straně replikační vidlice zůstává navázána na molekulu polymerázy vedoucího řetězce DNA, aby bylo zajištěno, že stejná polymeráza opožděného řetězce je znovu a znovu používána k účinné syntéze Okazakiho fragmentů18,20,21 (rámeček 1). A replikace DNA není v žádném případě jedinečná. Nyní se domníváme, že téměř každý biologický proces je katalyzován souborem deseti nebo více prostorově rozmístěných, vzájemně se ovlivňujících proteinů, které podstupují vysoce uspořádané pohyby v sestavě podobné stroji22.

Proteinové stroje se obecně tvoří na specifických místech v reakci na konkrétní signály, a to platí zejména pro proteinové stroje, které působí na DNA. Replikace, opravy a rekombinace dvojité šroubovice DNA jsou často považovány za samostatné, izolované procesy. Uvnitř buňky je však tatáž molekula DNA schopna podstoupit kteroukoli z těchto reakcí. Navíc dochází ke specifickým kombinacím těchto tří typů reakcí. Například rekombinace DNA je často přímo spojena buď s replikací DNA, nebo s opravou DNA23. Aby byla správně zachována integrita chromozomu, musí být každá specifická reakce pečlivě řízena a kontrolována. To vyžaduje, aby byly na DNA sestaveny sady proteinů, které se aktivují pouze tam a tehdy, kdy jsou potřeba. Ačkoli se o tom, jak se tato rozhodnutí provádějí, musíme ještě mnoho dozvědět, zdá se, že různé typy struktur DNA jsou explicitně rozpoznávány specializovanými proteiny, které slouží jako „montážní faktory“. Každý montážní faktor pak slouží k zárodku kooperativního sestavení souboru bílkovin, které tvoří konkrétní bílkovinný stroj, podle potřeby pro katalyzování reakce vhodné pro daný čas a místo v buňce.

Pohled do budoucnosti

Stalo se zvykem, jak v učebnicích, tak v běžné vědecké literatuře, vysvětlovat molekulární mechanismy pomocí jednoduchých dvourozměrných kreseb nebo „karikatur“. Takové kresby jsou užitečné pro konsolidaci velkého množství údajů do jednoduchého schématu, jak je znázorněno v tomto přehledu. Celá generace biologů se však možná nechala ukolébat přesvědčením, že podstata biologického mechanismu byla zachycena, a celý problém je tedy vyřešen, jakmile vědec rozluští dostatečnou část hádanky, aby byl schopen nakreslit smysluplnou karikaturu tohoto typu.

V posledních několika letech je naprosto zřejmé, že od vědců bude vyžadováno mnohem více, než budeme moci tvrdit, že plně rozumíme procesu, jako je replikace DNA nebo rekombinace DNA. Nedávné projekty sekvenování genomu, snahy o mapování interakcí proteinů a studie v oblasti buněčné signalizace odhalily mnohem více složek a molekulárních interakcí, než bylo dříve známo. Například podle jedné z nedávných analýz používá S. cerevisiae, jednobuněčný „jednoduchý“ eukaryotický organismus (který má asi 6 000 genů ve srovnání s 30 000 u člověka), 88 genů pro replikaci DNA a 49 genů pro rekombinaci DNA24.

Zaměříme-li se na replikaci DNA, bude úplné pochopení tohoto mechanismu vyžadovat návrat tam, kde studium DNA poprvé začalo – do oblasti chemie a fyziky. Bude zapotřebí detailní atomové struktury všech relevantních proteinů a nukleových kyselin a strukturní biologové díky stále výkonnějším technikám rentgenové krystalografie a nukleární magnetické rezonance dosahují velkolepého pokroku. Ale schopnost rekonstruovat biologické procesy ve zkumavce s molekulami, jejichž přesné struktury jsou známy, nestačí. Proces replikace je velmi rychlý a zároveň neuvěřitelně přesný a dosahuje konečné chybovosti přibližně jednoho nukleotidu z miliardy. Pochopení toho, jak jsou reakce mezi mnoha různými proteiny a dalšími molekulami koordinovány, aby vznikl tento výsledek, bude vyžadovat, aby experimentátoři určili všechny rychlostní konstanty interakcí mezi jednotlivými složkami, což dnes molekulární biologové dělají jen zřídka. Poté mohou pomocí technik genového inženýrství měnit vybrané soubory těchto parametrů a pečlivě sledovat vliv těchto změn na proces replikace.

Vědci budou moci tvrdit, že skutečně rozumí tak složitému procesu, jako je replikace DNA, teprve tehdy, až budou schopni přesně předpovědět vliv změn každé z různých rychlostních konstant na celkovou reakci. Protože škála experimentálních manipulací je obrovská, budeme potřebovat výkonnější způsoby rozhodování o tom, které takové změny s největší pravděpodobností zvýší naše porozumění. Je proto třeba vyvinout nové přístupy z rychle se rozvíjejícího oboru výpočetní biologie – jak pro vedení experimentů, tak pro interpretaci výsledků.

Watsonův-Crickův model DNA katalyzoval dramatický pokrok v našem molekulárním chápání biologie. Jeho obrovský úspěch zároveň dal vzniknout mylnému názoru, že mnoho dalších složitých aspektů biologie lze podobně zredukovat na elegantní jednoduchost pomocí pronikavé teoretické analýzy a tvorby modelů. Tento názor byl v následujících desetiletích nahrazen, protože se ukázalo, že většina biologických subsystémů je příliš složitá na to, aby bylo možné předvídat jejich detaily. Nyní víme, že nic nemůže nahradit přísné experimentální analýzy. Tradiční molekulární a buněčná biologie však sama o sobě nedokáže problém, jako je replikace DNA, uzavřít. Bude zapotřebí nových typů přístupů, které budou zahrnovat nejen nové výpočetní nástroje, ale také větší integraci chemie a fyziky20,25. Z tohoto důvodu musíme naléhavě přehodnotit vzdělávání, které poskytujeme příští generaci biologických vědců22,26.

.