Výsledky a diskuse
Stabilita genomu VARV a fylogenetická analýza
Pro evoluční studium VARV byla využita dostupnost sekvencí genomu ze souboru izolátů VARV s širokým geografickým rozšířením (obr. 1) (4). VARV, člen rodu Orthopoxvirus, obsahuje jediný lineární dvouvláknový genom DNA o velikosti 186 kb, který kóduje většinu enzymů pro jeho šíření (5). Studované izoláty VARV vykazovaly nízkou míru mutací, protože epidemiologicky spojené izoláty vykazovaly malé nebo žádné sekvenční změny ve vzorcích s časovým odstupem sběru až 1 rok . Tato nízká míra mutací je jasně patrná u našich geneticky identických vzorků z Bangladéše odebraných v letech 1974 a 1975. Tyto vzorky jistě představují dlouhé komplexní řetězce přenosu z jedné z nejhustěji osídlených oblastí na světě, ale mají identické nebo téměř identické nukleotidové sekvence. Příbuzný virus opičích neštovic Orthopoxvirus podobně vykazuje jednotlivé nebo žádné nukleotidové změny mezi izoláty ze tří různých hostitelů v nedávném ohnisku ve Spojených státech (6). V rámci jednotlivých druhů ortopoxvirů i mezi nimi mají genomy nukleotidovou identitu >99,6 % mezi izoláty VARV a 98 % mezi VARV a příbuznými taxony, jako je virus taterapox (TATV) (4) (západní Afrika) a virus camelpox (CMLV) (7) (střední Asie) (tabulka 1), dva druhy s nejvyšší sekvenční podobností s VARV (4). Velká velikost a pomalá rychlost nukleotidových substitucí umožňují genomické DNA VARV zachovat fylogeneticky informativní mutace a zároveň snižují výskyt homoplastických mutací (tj. menší počet zvratů znakového stavu). Rozmanitost 47 nedávno sekvenovaných genomů VARV byla do značné míry spojena s geografickým původem izolátů (ref. 4 a tato studie) a mutace měly minimální souvislost s časovou variabilitou mezi izoláty. Tato pozorování ukazují, že se nejednalo o jediný pandemický kmen ( SI Text , pozn. 1), ale že genetické kladie těchto analýz jsou spíše reprezentativní pro staré a možná starobylé lokálně endemické kmeny.
Hypotézy o původu VARV. Událost 0, Vysoká podobnost genomových sekvencí VARV s CMLV a TATV naznačuje, že TATV a CMLV mají s VARV společného nedávného předka než ostatní známé druhy ortopoxvirů. Případ 1, hypotéza A: Předek VARV se rozdělil do dvou primárních kladů (P-I a P-II) a vyvíjel se nezávisle ve Starém a Novém světě sledováním svých lidských hostitelů. Případ 1, hypotéza B: Divergence P-I/P-II v Africe. Událost 2, hypotézy A a B: Dlouhá jediná větev a následná radiace P-I naznačují, že ancestrální VARV P-I pravděpodobně vznikl v severovýchodní Asii a že endemity neštovic P-I se začaly šířit do východní Asie, na Blízký východ a do Indie, jakmile se místní populace dostatečně rozrostly. Událost 2a, Diverzifikace a migrace P-I po celé Asii. Událost 2b, Západní průzkum přinesl VARV major do jižní Afriky z indického subkontinentu, který se pak rozšířil na sever do střední Afriky a na Africký roh (Somálský poloostrov). Události 3 a 4, hypotéza A: Diverzifikace P-II v Novém světě následovaná jeho reintrodukcí do Afriky; hypotéza B:
Pokud radiace P-I představuje historii endemie neštovic ve Starém světě, vysvětluje to historickou záhadu týkající se absence popisu neštovic v literatuře starověkých řeckých a římských civilizací (1). Je pravděpodobné, že k epidemiím neštovic v této oblasti došlo později než ve starověké Číně a Indii. „Athénský mor“ z roku 430 př. n. l. popsaný Thukydidem, který byl kdysi považován za neštovice (3), by této teorii odporoval, ale nedávno bylo zjištěno, že se jednalo o břišní tyfus (25). Za vlády Ramsese V. se Egypt nacházel v občanské válce a byl napaden nepřáteli ze severu (3); pokud by puchýřovitá erupce za vlády Ramsese V. byla způsobena neštovicemi, mohla by představovat spíše epidemii neštovic z importovaných případů kvůli válce než regionální endemickou nemoc. Tuto hypotézu podporuje skutečnost, že pouze tři mumie z tohoto období měly podobné léze (2).
Diverzifikace alastrim minor
Analýzy založené na historii neštovic/VARV topologii ukazují, že divergence alastrim minor a západoafrické varioly začala nejméně před 800 lety (tabulka 2 a tabulka SI 4), což předchází předchozí hypotéze, že se tato divergence shoduje s počátkem obchodu s otroky. Podle starobylejší hypotézy původu mohlo k této divergenci dojít po události speciace buď v Novém světě (na základě kalibrace z nejstarších historických záznamů o neštovicích; obr. 3 A), nebo v západní Africe (na základě kalibrace z historických záznamů o neštovicích v jižní Africe; obr. 3 B). Tyto scénáře by naznačovaly, že existovaly neidentifikované izoláty variola minor/alastrim, které existovaly buď v Africe, nebo v Novém světě mnohem dříve než objevení alastrimu minor (P-II); tento taxon má tedy delší historii, než bylo popsáno.
Ačkoli dobře zdokumentovaný import VARV major do Ameriky měl devastující účinek na mnoho domorodých populací (2), záznamy o rychlém šíření nemoci s velkou úmrtností lze částečně přičíst kombinovanému účinku vysoké hustoty populace, nedostatku základní péče o oběti a možným koinfekcím s jinými nemocemi Starého světa (26, 27). Z historického hlediska existuje jen málo záznamů o neštovicích v západní Africe a Henige (28) tvrdil, že první velké ohnisko neštovic VARV v Novém světě nepocházelo ze západní Afriky, což by vyvracelo hypotézu o rané historii neštovic v západní Africe. Je možné, že po dávné introdukci se alastrim vyvinul nezávisle v izolovaných oblastech v rámci velké geografické oblasti Nového světa. Phelanova studie totiž ukázala, že původní populace ekvádorské vysočiny se během počáteční španělské nadvlády (které je připisováno, že do Nového světa zavedla VARV major) nesnížily (29), což naznačuje, že tyto populace mohly být odolnější vůči neštovicím, možná díky předchozímu kontaktu s alastrimem. Na Trinidadu bylo v roce 1902 doloženo, že mírné ohnisko neštovic pocházelo z této oblasti (30). Pokud k této diverzifikaci došlo v Novém světě, pak by primární izolační událost byla pravděpodobně důsledkem přesunu ancestrálního VARV s ranými lidmi do této oblasti (obr. 4A). Absence znaků SNP naznačujících míšení mezi P-I a P-II (obr. SI 6 a 7), konzistentní a významně odlišné klinické charakteristiky alastrimu od tradičního VARV major P-I (31) by mohly být vysvětleny takovou významnou geografickou separací.
Pokud k rozdělení P-I/P-II došlo v rámci Starého světa, P-II pravděpodobně vznikl v západní Africe. Obě subklády P-II by se pak rozdělily ≈800-1 100 YBP (tabulka 2 a tabulka SI 4) na africkém kontinentu. Geografické rozšíření těchto událostí je obtížné určit, protože v těchto oblastech chybí písemná historie. Přítomnost a diverzifikace dalších blízce příbuzných ortopoxvirů, jako jsou opičí neštovice a TATV, by však mohla podporovat africký původ předků VARV. Pokud k izolaci a diverzifikaci P-II došlo v Africe, pak na základě naší fylogeneze existuje nepopsaný africký zástupce ze subklády P-II, který byl zavlečen do Nového světa možná stovky let po diverzifikační události, možná v době obchodu s otroky mezi zeměmi Starého a Nového světa (obr. 1). 3 B).
Nedostatečné poznání historie těchto kultur a relativně mírnější klinické příznaky (s ohledem na variola major) přispívají k tomu, že neexistuje rozsáhlejší historický záznam o onemocnění(ch) pravými neštovicemi v Novém světě ani v subsaharské Africe. Historická hustota lidské populace v obou těchto oblastech byla nižší než v oblastech s endemickým výskytem variola major. V případech mírnějšího průběhu onemocnění by byli jedinci v době nákazy mobilnější a měli by větší počet kontaktů, a tak by se šíření nemoci udržovalo. Na podporu této hypotézy lze uvést, že ohniska mírných neštovic v Somálsku přetrvávala po dlouhou dobu mezi malými kočovnými skupinami a vykazovala výrazně odlišný způsob přenosu ve srovnání s VARV major (2). Ačkoli není známo, zda praxi variování/očkování používaly domorodé národy Afriky nebo Ameriky, dlouhá životnost VARV v rekonvalescentních strupech (až deset let) (32-34) by poskytovala další mechanismus pro opakované zavlečení kmene neštovic v rámci geografické komunity buď neúmyslným kontaktem se strupovým materiálem, nebo přímo prostřednictvím praktik variování.
Původ VARV.
Možná vodítka ohledně adaptace VARV na člověka lze nalézt v úzkém vztahu mezi VARV a TATV/CMLV (4). TATV je spojován se suchozemským hlodavcem pocházejícím ze západní Afriky (35). Naše koalescenční analýzy ukazují, že k divergenci mezi VARV a TATV došlo v období od 16 000 let před naším letopočtem (tabulka 2 a SI Dataset 4, na základě historických záznamů o neštovicích v Jižní Africe) do 68 000 let před naším letopočtem (tabulka 2 a SI Dataset 3, na základě nejstarších záznamů o neštovicích ve východní Asii). VARV se tedy podobně jako příbuzné zoonotické ortopoxviry s rezervoárem u hlodavců (6, 36, 37) mohl vyvinout z enzootického patogenu afrických hlodavců a následně se rozšířit mimo Afriku.
Genomické sekvence izolátů VARV vybraných pro tuto studii byly převzaty z repozitáře World Health Organization Collaborating Center, a přestože vykazují nízkou úroveň sekvenční divergence, reprezentují největší geografickou a časovou diverzitu v rámci této kolekce. Fylogeneze těchto izolátů odvozená z cSNP vytváří topologii odpovídající historickým vzorcům lidské migrace, populační expanzi a zdokumentovaným epidemiím neštovic. Zobrazená topologie podporuje hypotézu (obr. 3), že dvě kladie varioly se oddělily od ancestrálního viru a následně se vyvinuly v geograficky oddělených lidských populacích. Ačkoli důvod rozdílné lidské patogeneze alastrimu a VARV major není jasný, genetická struktura alastrimu minor a jeho topologie s ostatními izoláty VARV přidávají důležité dílky do evoluční skládačky neštovic. Tato navrhovaná fylogeneze VARV prodlužuje dobu evoluce pravých neštovic oproti předchozím teoriím.