Dávkové a časové účinky příjmu kofeinu na adenosin A2A receptory lidských krevních destiček

Kofein, který se nachází v různých zdrojích, jako je káva, čaj, čokoláda a kolové nápoje, je nejrozšířenější účinnou látkou na světě. Průměrná spotřeba kofeinu u dospělých lidí se v různých kulturách a národech pohybuje od 80 do 400 mg na osobu a den.1 Kofein vyvolává různorodé farmakologické reakce, včetně zvýšené bdělosti, zkrácení psychomotorické reakční doby a prodloužení latence spánku a doby bdění, a může také ovlivňovat intelektuální výkonnost.2 Kofein navíc způsobuje relaxaci hladkého svalstva, zvyšuje sekreci žaludeční kyseliny a uvolňování katecholaminů a zvyšuje metabolickou aktivitu.3

Přesný mechanismus (mechanismy), který (které) je (jsou) základem působení kofeinu, není (nejsou) dosud dostatečně definován (definovány). Ačkoli k účinkům kofeinu může přispívat inhibice fosfodiesterasy,4 přibývá důkazů, že většina farmakologických účinků tohoto xanthinu je důsledkem antagonismu adenosinových receptorů označovaných jako podtypy A1, A2A, A2B a A3.5 Kofein působí nejsilněji na receptory A2A, těsně následované receptory A1, pak receptory A2B6 a jako slabý antagonista na lidské receptory A3. Blokáda adenosinových receptorů, konkrétně receptorů typu A1 a A2A, kofeinem inhibuje působení endogenního adenosinu na řadu fyziologických procesů.7 Za normálních podmínek se zdá, že hladiny adenosinu v krvi jsou dostatečné k tonické aktivaci receptorů A2A v krevních destičkách. Nedávno bylo zjištěno, že u myší s vyřazeným receptorem A2A dochází ke zvýšené agregaci destiček, což naznačuje význam tohoto podtypu receptoru pro funkci destiček.8 Lze tedy předpokládat, že kofein by mohl blokovat tyto tonicky aktivované receptory A2A v krevních destičkách a měnit jejich funkce modulované adenosinem.

Po mnoho let se předpokládala souvislost mezi pitím kávy a kardiovaskulárními onemocněními, zejména ischemickou chorobou srdeční,9 nedávno se však ukázalo, že konzumace kávy nebo kofeinu nezvyšuje riziko ischemické choroby srdeční nebo mozkové mrtvice.1011 Četné epidemiologické studie zabývající se infarktem myokardu nezjistily žádný škodlivý účinek <5 šálků kávy denně, zatímco při vyšším příjmu jsou výsledky sporné.12 U pacientů s hypertenzí nebylo pozorováno žádné nepříznivé výsledné riziko při jakékoli úrovni příjmu kofeinu.13

Studie Biaggioniho a spol.14 zjistila, že opakované dávkování kofeinu vede u lidských krevních destiček k významným změnám funkčních odpovědí na agonistu adenosinových receptorů 5′-N-ethylkarboxamidoadenosin (NECA). Vysazení kofeinu způsobilo významný posun inhibice agregace vyvolané NECA směrem doleva14. V souladu s tím jsme nedávno prokázali,15 že u osob léčených 750 mg/d po dobu 1 týdne chronický příjem kofeinu mění agregabilitu trombocytů v důsledku upregulace receptorů A2A umístěných na povrchu trombocytů.

V tomto článku přinášíme další důkaz, že podobná odpověď se objevuje u osob léčených kofeinem v různých dávkách, jako je 600 mg/d po dobu 1 týdne nebo 400 mg/d, podávaných po delší dobu, např. 2 týdny. V této studii to bylo provedeno přímým měřením změn adenosinových A2A receptorů (hustota a afinita) a jejich funkce stanovením účinku selektivního A2A agonisty 2-hexynyl-NECA (HE-NECA) na (1) zvýšení akumulace cAMP, (2) inhibici agregace destiček a (3) snížení intracelulární hladiny vápníku. Po chronické konzumaci (600 mg/d po dobu 1 týdne nebo 400 mg/d po dobu 2 týdnů) byla zjištěna upregulace destičkových adenosinových A2A receptorů, která vysoce korelovala s antiagregačními účinky, zvýšením akumulace cAMP a snížením intracelulární hladiny vápníku. U subjektů léčených 400 mg/d po dobu 1 týdne nebyly zjištěny žádné rozdíly ve vazebných a funkčních parametrech.

Metody

Studováno bylo 45 zdravých nekuřáků obou pohlaví ve věku 25 až 45 let. Po udělení písemného informovaného souhlasu byly subjekty požádány, aby se po dobu ≥ 2 týdnů zdržely užívání methylxantinů ve stravě. Byli rozděleni do 3 skupin (po 15 subjektech) podle režimu podávání kofeinu (tj. dávky a délky podávání): 200 mg perorálně 2krát denně po dobu 7 dnů (skupina 1); 200 mg perorálně 2krát denně po dobu 14 dnů (skupina 2); a 200 mg perorálně 3krát denně po dobu 7 dnů (skupina 3). Krevní destičky těchto subjektů byly zkoumány před zahájením užívání kofeinu (den 0) a 1, 12, 60 a 108 hodin po poslední dávce kofeinu. Zejména časový bod 1 hodiny byl studován pouze u skupiny, která dostávala maximální dávku kofeinu (600 mg/d). EC50 a IC50 ve funkčních testech nebylo možné získat za 1 hodinu kvůli praktickým problémům spojeným s nadměrným odběrem krve v úzkém časovém úseku (1 až 12 hodin).

Vazbový test SCH 58261 v membránách lidských krevních destiček

Membrány z lidských krevních destiček byly připraveny podle předchozího popisu16 a použity pro vazebné testy radioligandů s SCH 58261 podle Varaniho a spol.17. Při saturačních studiích byly membrány lidských trombocytů inkubovány s 8 až 10 různými koncentracemi SCH 58261 v rozmezí 0,01 až 10 nmol/l. Nespecifická vazba byla stanovena v přítomnosti NECA 10 μmol/l. Po 60 minutách inkubace při 4 °C byly vzorky filtrovány přes filtry Whatman GF/B pomocí přístroje Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co). K počítačové analýze dat z nasycovacích experimentů byl použit vážený nelineární program pro fitování křivek metodou nejmenších čtverců, LIGAND18.

Měření hladin cAMP v lidských krevních destičkách

Propláchnuté lidské krevní destičky získané z periferní krve zdravých dobrovolníků byly připraveny podle předchozího popisu16. Trombocyty (6×104 až 8×104 buněk) byly inkubovány s 1,0 U adenosindeaminázy/ml, 0,5 mmol/l 4-(3-butoxy-4-methoxybenzyl)-2-imidazolidinonu (Ro 20-1724) jako inhibitoru fosfodiesterázy a 6 až 8 různými koncentracemi HE-NECA. Hodnoty EC50 byly získány z křivek koncentrace-odpověď po logaritmické transformaci závislých proměnných metodou vážených nejmenších čtverců.19 Výsledný vodný roztok byl testován na hladinu cAMP pomocí testu kompetitivní vazby na proteiny.15

Test agregace krevních destiček

Citrovaná lidská krev byla centrifugována při 200 g po dobu 10 minut pro získání plazmy bohaté na krevní destičky a při 2500 g po dobu 20 minut pro získání plazmy chudé na krevní destičky. Počet lidských trombocytů byl proveden na počítadle Coulter Counter model S8/80 (Coulter Electronics Inc.) a upraven na 2,5×108/ml až 3,5×108/ml s autologní plazmou chudou na trombocyty. Agregace trombocytů byla provedena podle Bornovy turbidimetrické techniky20 pomocí přístroje DIC PA-3220 Aggrecorder (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Po 3minutové inkubaci s 6 až 8 různými koncentracemi HE-NECA byla plazma bohatá na destičky agregována při 37 °C za kontinuálního míchání s ADP. Podobné experimenty byly provedeny s ADP o různých koncentracích (100 nmol/l až 100 μmol/l). Pro kvantitativní analýzu byla použita maximální agregace zaznamenaná 5 minut po přidání ADP a bylo vypočteno procento inhibice ve vztahu ke kontrolním hodnotám.21

Měření koncentrace volného Ca2+ v cytoplazmě

Koncentrace volného vápníku v cytoplazmě byla měřena pomocí techniky fura 2 podle Paula a spol.22 . Stručně řečeno, trombocyty byly inkubovány v úplné tmě po dobu 30 minut při 37 °C s 1 μmol/l fury 2-AM a magneticky míchány ve fluorimetrických kyvetách (LS50, Perkin Elmer, Ltd) v koncentraci 108/ml v přítomnosti 250 μmol/l sulfinpyrazonu. Intracelulární koncentrace Ca2+ (i) byla stanovena při excitačním poměru 340/380 a emisní vlnové délce 505 nm.

Statistická analýza

Analýza dat byla provedena pomocí 1-way ANOVA. Analýza rozdílů mezi skupinami léčenými kofeinem (12, 60 a 108 hodin) a kontrolními subjekty byla provedena pomocí Studentova t-testu (nepárová analýza). Rozdíly byly považovány za významné při hodnotě P<0,01. Všechny údaje jsou uváděny jako průměr±SEM.

Výsledky

Trombocyty ze 3 skupin subjektů byly odebrány před zahájením podávání kofeinu (den 0, kontrola) a 1, 12, 60 a 108 hodin po poslední dávce (vysazení kofeinu). Tabulka shrnuje výsledky vazebných a funkčních experimentů u 3 skupin subjektů.

Skupina 1 (400 mg/d po dobu 1 týdne)

Vazebné parametry odhalily kontrolní hodnotu Bmax 105±6 fmol/mg proteinu a hodnotu KD 1,28±0,08 nmol/l. V kontrolních trombocytech HE-NECA zvyšoval hladinu cAMP s EC50 60±5 nmol/L a inhiboval (1) agregaci s IC50 86±10 nmol/L a (2) hladinu vápníku s IC50 104±8 nmol/L. Nebyly zjištěny žádné statisticky významné rozdíly ve vazebných a funkčních parametrech po 12, 60 a 108 hodinách po vysazení kofeinu (tabulka).

Skupina 2 (400 mg/d po dobu 2 týdnů)

Vazebné parametry odhalily kontrolní hodnotu Bmax 110±3 fmol/mg proteinu a hodnotu KD 1,21±0,09 nmol/L. Za 12 a 60 hodin po vysazení kofeinu se hustota receptorů, Bmax, zvýšila v obou časových bodech přibližně o 20 %, ale hodnoty KD se nezměnily. Funkční experimenty ukázaly, že agonista adenosinového receptoru A2A HE-NECA byl významně účinnější při zvyšování cAMP v destičkách (tj. hodnoty EC50 byly za 12 a 60 hodin po vysazení kofeinu o 45 %, resp. 65 % nižší než kontrolní hodnoty). Podobný trend byl pozorován u hodnot IC50 získaných v agregačních experimentech a při měření koncentrace volného vápníku v cytoplazmě (tabulka).

Skupina 3 (600 mg/d po dobu 1 týdne)

Obecně jsme získali podobné údaje jako u skupiny 2. SCH 58261 se vázal na jednu třídu afinitních míst v membránách krevních destiček z kontrol s Bmax 100±4 fmol/mg proteinu a KD 1,27±0,09 nmol/L. Jak ukazuje obrázek 1A, v membránách trombocytů odebraných 1, 12, 60 a 108 hodin po vysazení kofeinu se radioligand vázal se stejnou afinitou, ale počet vazebných míst (Bmax) byl významně vyšší (P<0,01). V paralelních studiích byly stanoveny funkční odpovědi krevních destiček na agonistu receptoru A2A HE-NECA. Jak je shrnuto v tabulce, účinnost HE-NECA na (1) zvýšení tvorby cAMP, (2) inhibici agregace destiček vyvolané ADP a (3) snížení hladiny vápníku byla významně zvýšena u destiček získaných 12, 60 a 108 hodin po vysazení kofeinu (obr. 1B, 1C a 1D). Byly rovněž provedeny pokusy s cílem zjistit, zda zvýšení hustoty receptorů A2A bude doprovázeno snížením účinnosti a/nebo efektivity ADP při vyvolávání agregace. Hodnoty EC50 ADP pro stimulaci agregace destiček po 12, 60 a 108 hodinách po vysazení kofeinu byly 0,7±0,2, 0,9±0,1 a 0,8±0,1 μmol/l, což jsou hodnoty, které se významně neliší od 0,9±0,1 μmol/l, resp.2 μmol/l získané u krevních destiček z kontrol (obrázek 2).

Diskuse

Účinky dlouhodobého podávání kofeinu u lidí a zvířat a jeho role v jejich toleranci vůči účinkům kofeinu jsou kontroverzní. Některé studie, které prokázaly zvýšení počtu receptorů A1 v mozku myší, nalezly důkaz o upregulaci receptorů A1 kofeinem v závislosti na dávce.23 Jiné studie odhalily upregulaci receptorů A2A, což naznačuje adaptační účinek příjmu kofeinu.24 Navíc chronická konzumace kofeinu může vést ke snížení agregability krevních destiček v důsledku upregulace receptorů A2A umístěných na povrchu krevních destiček14 , které hrají potenciální roli v patofyziologických procesech, jako je agregace a trombogeneze. Ačkoli tyto změny mohou přispívat ke změnám ve funkci krevních destiček, tolerance ke kofeinu nemění účinnost tohoto xanthinu jako kompetitivního antagonisty účinků adenosinu.25 Na fenoménu tolerance se mohou podílet i další změny, jako je posun afinity receptorů do stavu vysoké afinity, změny v hladinách G proteinů nebo ve spojení těchto proteinů s adenosinovými receptory nebo dlouhodobé obsazení receptorů.26 U lidí se vyskytují příznaky z vysazení kofeinu; typicky se jedná o bolesti hlavy, únavu, apatii a ospalost.9 Zejména kofein zvyšuje plazmatickou koncentraci adenosinu a její snížení po vysazení antagonisty naznačuje receptorovou regulaci plazmatické koncentrace adenosinu.27 Během ischemie a/nebo hypoxie má adenosin také neuroprotektivní účinky. V dospělém mozku chronická léčba kofeinem, která vede k upregulaci adenosinových receptorů, snižuje ischemické poškození, zatímco akutní expozice (antagonistický účinek na receptory) ischemické poškození zvyšuje.28

Bylo prokázáno, že chronický příjem kofeinu mění odpověď krevních destiček na působení adenosinu.14 Opakované podávání kofeinu (750 mg/d po dobu 1 týdne) odhalilo zvýšení hustoty A2A receptorů doprovázené senzitizací reakcí destiček, jako je zvýšení akumulace cAMP a snížení agregace destiček.15 Cílem této studie bylo zjistit vliv dávky kofeinu a délky podávání na vazebné a funkční parametry. Proto jsme studovali změny hustoty a afinity adenosinových A2A receptorů v membránách lidských trombocytů osob léčených různými dávkami (400 nebo 600 mg/d) po různou dobu příjmu kofeinu (1 nebo 2 týdny). Konkrétně jsme studovali kontrolní skupinu (před podáním kofeinu) a osoby léčené kofeinem (1, 12, 60 a 108 hodin po poslední dávce kofeinu).

Léčba 400 mg/d kofeinu po dobu 1 týdne nezměnila vazebné a funkční parametry receptorů A2A. Léčba 400 mg/d po dobu 2 týdnů nebo 600 mg/d po dobu 1 týdne však vedla k (1) významnému zvýšení (upregulaci) vazebných míst adenosinu A2A, (2) zvýšení akumulace cAMP, (3) zvýšení antiagregačních účinků a (4) snížení hladiny vápníku vyvolané agonistou receptoru A2A HE-NECA.

Upregulaci receptorů A2A lze pravděpodobně přičíst syntéze nových receptorů během diferenciace prekurzorových buněk. Tato interpretace je založena na výsledcích experimentů in vitro, které ukázaly, že inkubace plazmy bohaté na destičky od kontrolních subjektů po dobu 6 nebo 12 hodin s kofeinem nebo SCH 58261 neovlivnila vazebné parametry.15 Upregulace adenosinových A2A receptorů způsobená chronickým příjmem kofeinu by mohla být interpretována tak, že endogenní adenosin má tonizující vliv na lidské krevní destičky a přítomnost antagonisty je vyvážena upregulací A2A receptorů. U dospělých se kofein účinně adsorbuje z gastrointestinálního traktu; maximální plazmatické koncentrace se objevují 15 až 120 minut po požití a poločas kofeinu je 2,5 až 4,5 hodiny7. Nárůst adenosinových A2A receptorů zjištěný 1 hodinu po podání poslední dávky kofeinu byl podobný nárůstu získanému po 12 nebo 60 hodinách po vysazení kofeinu, což ukazuje, že vysazení nebylo pro upregulaci A2A receptorů nezbytné.

Dalším cílem této studie bylo určit, zda změny vazebných parametrů korelují se změnami funkční odpovědi (odpovědí). Bylo zjištěno, že agregace destiček byla spojena s aktivací adenylátcyklázy a se zvýšením intracelulární koncentrace vápníku. Účinnost HE-NECA po 12, 60 a 108 hodinách od vysazení kofeinu byla významně zvýšena ve srovnání s kontrolní skupinou. Toto zjištění naznačuje, že opakované podávání různých dávek kofeinu vede k významným změnám v počtu A2A receptorů na povrchu krevních destiček, které jsou doprovázeny zvýšenou reaktivitou na stimulaci receptorů. Klasický adenosinový receptor A2A je zodpovědný za antiagregační vlastnosti adenosinu a jeho analogů, což je v souladu s pozorováním, že agregace je účinnější u myší s nedostatkem receptorů A2A.8 Nicméně agregace destiček vyvolaná zvyšujícími se koncentracemi ADP se mezi kontrolními subjekty a subjekty léčenými kofeinem významně nelišila. Jedním z možných vysvětlení tohoto posledního pozorování je, že v testovacím médiu není dostatek adenosinu k vyvolání odpovědi. Případně u subjektů léčených kofeinem nebyla velikost regulace receptorů (tj. počet receptorů) dostatečná k tomu, aby způsobila posun křivky závislosti agregace na koncentraci ADP. Když se však zvýší hladina endogenního adenosinu, například během ischemie myokardu, extracelulární koncentrace adenosinu rychle stoupne na úroveň dostatečnou k působení na upregulované receptory a může mít větší inhibiční účinky na destičky než kontrola. Je tedy možné, že chronická konzumace kofeinu v dávkách, které nejsou daleko od průměrného příjmu v potravě, může vést k paradoxnímu snížení agregability destiček během ischemie.

Všechny údaje dohromady tedy poskytují další důkaz, že chronický příjem kofeinu mění reakci destiček na působení adenosinu. Hlavním zjištěním této studie je, že účinky chronické konzumace kofeinu na funkce destiček jsou závislé jak na dávce, tak na délce trvání léčby a jsou základem snížení agregability destiček v důsledku upregulace adenosinových receptorů A2A.

Poznámky

.