Buňky dospělého lidského srdce

Vykazování údajů

K předurčení velikosti vzorku nebyly použity žádné statistické metody. Experimenty nebyly randomizovány a vyšetřovatelé nebyli během experimentů a hodnocení výsledků zaslepeni ohledně alokace.

Etika výzkumu dárcovských tkání

Srdeční tkáně (dárci D1-D7 a D11) byly zpracovány ve Wellcome Sanger Institute (Hinxton, Spojené království) a získány od zemřelých dárců transplantovaných orgánů po schválení etickou komisí pro výzkum (ref. 15/EE/0152, East of England Cambridge South Research Ethics Committee) a informovaném souhlasu rodin dárců. Srdeční tkáně (dárci H2-H7) byly zpracovány na Harvard Medical School (Boston, Massachusetts, USA) a získány od zemřelých dárců orgánů po schválení Human Research Ethics Board Pro00011739 (University of Alberta, Edmonton, Kanada). Informovaný souhlas rodin dárců byl získán prostřednictvím institucionálního programu Human Organ Procurement and Exchange Program (HOPE). Kardiovaskulární anamnéza byla u všech dárců bez pozoruhodností (doplňková tabulka 1).

Odběr a zpracování tkání

Tkáně byly získány od dárců ze Spojeného království a Severní Ameriky (D1-7 a 11, H2-7) po oběhové smrti (DCD) (D2, D4-D7 a D11) a po smrti mozku (DBD) (D1, D3, H2-H7). U dárců ve Spojeném království, kteří zemřeli při DCD, se po pětiminutovém odstupu a při DBD otevře hrudník, zkříží se aorta a odeberou se srdeční vzorky. U severoamerických dárců DBD se aorta zkříží, přes aortu se pod tlakem podá studená kardioplegie (Celsior), aby se zastavil tep, srdce se vyřízne, propláchne se studeným fyziologickým roztokem a získají se vzorky. Všechny dárcovské vzorky byly biopsie myokardu v celé tloušťce z levé a pravé síně, levé a pravé komory, interventrikulárního septa a apexu se záměrným vyloučením velkých epikardiálních tukových ložisek. Vzorky použité pro izolaci jednotlivých jader byly bleskově zmraženy a uloženy při -80 °C. Izolace jednotlivých buněk a obohacení CD45+ bylo provedeno na čerstvě odebraných vzorcích. Zbytky tkáně po procedurách izolace jader a buněk byly fixovány ve formalínu nebo zmrazeny v OCT pro další studie.

Všechny tkáně byly po celou dobu až do zmrazení nebo disoluce tkáně skladovány a přepravovány na ledu, aby se minimalizovala jakákoli transkripční degradace. Předchozí studie postmortální stability tkání konsorcia GTEx na objemných tkáních68 a v jednotlivých buňkách69 naznačují pouze malé změny ve tkáních během prvních 24 hodin post mortem při skladování v chladných podmínkách.

Izolace jednotlivých jader

Jednotlivá jádra byla získána z bleskově zmrazených tkání pomocí mechanické homogenizace, jak bylo popsáno dříve70. Tkáně byly homogenizovány pomocí 7ml skleněné sady tkáňového mlýnku Dounce (Merck) 8-10 údery volného pěchovadla (A) a 8-10 údery těsného pěchovadla (B) v homogenizačním pufru (250 mM sacharosa, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1× inhibitor proteázy, 0.4 U μl-1 RNaseIn, 0,2 U μl-1 SUPERaseIn, 0,1 % Triton X-100 ve vodě bez nukleáz). Homogenát byl filtrován přes 40 μm buněčné sítko (Corning). Po odstředění (500 g, 5 min, 4 °C) byl supernatant odstraněn a peleta byla resuspendována ve skladovacím pufru (1× PBS, 4 % hovězího sérového albuminu (BSA), 0,2 U μl-1 Protector RNaseIn). Jádra byla obarvena pomocí reagencií NucBlue Live ReadyProbes (ThermoFisher) a jednotlivá jádra pozitivní na Hoechst byla přečištěna pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS) s použitím influxu, XDP nebo FACSAria (BD Biosciences) (doplňkový obr. 1). Purifikace jader a jejich integrita byla ověřena pod mikroskopem a jádra byla dále zpracována pomocí přístroje Chromium Controller (10X Genomics) podle protokolu výrobce.

Příprava jednotlivých buněk

Srdeční tkáně (0.2-0,9 g) byly přeneseny z kardioplegického roztoku do šetrných zkumavek C-MACS (Miltenyi Biotec) obsahujících základní roztok pro enzymatické štěpení (100 μg ml-1 liberázy TH Research grade a 50 μg ml-1 DNázy I, HBSS 10 mM HEPES a 30 mM taurinu)71 . Tkáně byly rozřezány nůžkami (FST) a automaticky tráveny pomocí šetrnéhoMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) s ohřívači. Suspenze jednotlivých buněk zbavená kardiomyocytů byla promyta základním roztokem obsahujícím 20% fetální hovězí sérum (FBS) (Gibco), přefiltrována přes 70 μm nylonové sítko (BD Falcon), shromážděna centrifugací (330 g, 10 min, 4 °C) a resuspendována v základním roztoku obsahujícím 0,2% FBS (Gibco). Po každé centrifugaci byly buňky třikrát ručně spočítány pomocí vyloučení Trypanovy modři a resuspendovány v koncentraci nejméně 2 × 106 ml-1. Jednotlivé buňky byly zpracovány pomocí Chromium Controller (10X Genomics) podle protokolu výrobce.

Obohacení CD45+ buněk

Buněčná suspenze byla připravena podle výše uvedeného popisu a následně označena pomocí mikročástic konjugovaných s monoklonální protilátkou proti lidskému CD45 podle protokolu výrobce (Miltenyi Biotec). Stručně řečeno, až 107 buněk bylo inkubováno 15 minut při 4 °C v 80 μl pufru PBS, BSA, EDTA (1× PBS pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) obsahujícího 20 μl mikročástic CD45. Buněčná suspenze se jednou promyje v PBS, BSA, EDTA pufru a shromáždí centrifugací (330 g, 10 min, 4 °C). Resuspendované buňky byly naneseny na kolonky MACS LS (Miltenyi Biotec). Frakce buněk zbavená CD45 byla vyřazena po třech promytích PBS, BSA a EDTA pufrem a frakce CD45+ buněk byla shromážděna v PBS, BSA a EDTA pufru vyjmutím kolonek z magnetického pole. CD45+ buňky byly spočítány a resuspendovány v PBS, BSA a EDTA pufru na koncentraci nejméně 2 × 106 na ml před dalším zpracováním pomocí Chromium Controller (10X Genomics) podle protokolu výrobce.

Příprava knihovny Chromium 10X

Jednotlivé buňky a jádra byly spočítány ručně vyloučením Trypanovou modří nebo automaticky pomocí Countess II (Life Technologies) s použitím nejméně dvou samostatných počítání. Suspenze buněk nebo jader byla upravena na 400-1 000 buněk na mikrolitr a vložena na Chromium Controller (10X Genomics) s cílovou výtěžností 4 000-10 000 buněk nebo jader na reakci. 3′ knihovny genové exprese byly připraveny podle pokynů výrobce souprav Chromium Single Cell Reagent Kit v2 nebo v3 (10X Genomics). Kontrola kvality cDNA a konečných knihoven byla provedena pomocí přístroje Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent) nebo 4200 TapeStation System (Agilent). Knihovny byly sekvenovány pomocí HiSeq 4000 (Illumina) ve Wellcome Sanger Institute a NextSeq 500 (Illumina) na Harvard Medical School s minimální hloubkou 20 000-30 000 párů čtení na buňku nebo jádro (doplňková tabulka 22).

Prostorová validace pomocí smFISH se sondami RNAscope

Při přípravě vzorků fixovaných ve formalínu a zalitých do parafínu (FFPE) byla čerstvá tkáň fixována v neutrálním pufrovaném 10% formalínu po dobu 18-36 h a následně zalita do parafínových bloků. Zmrazené vzorky tkáně byly fixovány ve 4% paraformaldehydu (ThermoFisher). Řezy byly vyříznuty mikrotomem o tloušťce 5 μm a umístěny na sklíčka SuperFrost Plus (VWR). Tkáňová sklíčka FFPE byla automaticky obarvena pomocí BOND RX (Leica) a sady RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Assay (ACDBio) podle protokolu výrobce. Fixovaná zmrazená tkáňová sklíčka byla zpracována podle protokolu RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v1 (ACDBio). Připravené nebo vlastní cílové sondy RNAscope byly spuštěny paralelně k multiplexním pozitivním a negativním kontrolám (Extended Data Obr. 12b, Doplňková tabulka 23). Všechna jádra byla obarvena DAPI. Všechna tkáňová sklíčka FFPE byla zobrazena pomocí konfokálního screeningového systému Opera Phenix High-Content (Perkin Elmer) s velikostí kroku z 1 μm a 20× vodotěsným objektivem (NA 0,16, 0,299 μm na pixel). Kanály: DAPI (excitace 375 nm, emise 435-480 nm), Atto 425 (excitace 425 nm, emise 463-501 nm), opal 520 (excitace 488 nm, emise 500-550 nm), opal 570 (excitace 561 nm, emise 570-630 nm), opal 650 (excitace 640 nm, emise 650-760 nm). Fixované zmrazené tkáňové preparáty byly zobrazeny pomocí konfokálního mikroskopu LSM710 (Zeiss) a 40× objektivu s olejovou imerzí (olej 1,3, DIC III). Kanály: DAPI (excitace 375 nm, emise 435-480 nm), Alexa Fluor 488 (excitace 492 nm, emise 517 nm), Atto 550 (excitace 560 nm, emise 575 nm) a Atto 647 (excitace 649 nm, emise 662 nm). Vizualizace a odstranění pozadí (poloměr valivé koule) byly provedeny pomocí Fiji/ImageJ72. Pro lepší vizualizaci byly použity pseudobarvy.

Barvení hematoxylinem a eozinem

Vzorky tkání byly čerstvě zmrazeny v izopentanu (ThermoFisher) při -80 °C a vloženy do OCT (VWR). Řezy byly vyříznuty mikrotomem o tloušťce 10 μm, umístěny na sklíčka SuperFrostPlus (VWR) a dále zpracovány podle standardního protokolu barvení hematoxylinem a eozinem (rozšířená data, obr. 12a).

Získání tkáně kosterního svalstva

Vzorky mezižeberního svalstva byly získány z oblasti mezi druhým a třetím žebrem na levé straně. To je obvykle z nejhlubší vrstvy svalu (nejdále od kůže). Vzorky byly odebrány přímo do studeného konzervačního roztoku.

Izolace jader kosterního svalu

Svalová tkáň byla omyta v 1× PBS, očištěna od viditelných tukových usazenin a rozmělněna tak, aby byly získány fragmenty o velikosti přibližně 1 mm3. Na jeden vzorek bylo přibližně 0,3 g mleté tkáně homogenizováno ve 3 ml pufru A (250 mM sacharóza, 10 mg ml-1 BSA, 5 mM MgCl2, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasIn, 1× inhibitor proteáz) pomocí sady tkáňového mlýnku Dounce (Merck) s 50 údery volného tlouku (A). Homogenát byl přefiltrován přes 100 μm buněčné sítko (Corning) a sítko bylo promyto 1 ml a poté 750 μl pufru A. Po přidání Tritonu X-100 (konečná koncentrace 0,5 %) byla směs dále homogenizována 50 údery těsného tlouku (B). Po přefiltrování přes 40 μm sítko byla jádra centrifugována (3 000 g, 5 min, 4 °C), resuspendována v 1 ml pufru B (320 mM sacharosa, 10 mg ml-1 BSA, 3 mM CaCl2, 2 mM octan hořečnatý, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1× inhibitor proteáz, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasin) a přečištěna pomocí 27% gradientového roztoku Percollu. Směs Percollu byla odstředěna při 20 000 g (15 min, 4 °C) a pelet byl resuspendován ve 200 μl pufru B, následovala centrifugace (20 000 g, 3 min, 4 °C). Po obarvení Trypanovou modří byla intaktní jádra spočítána pomocí hemocytometru. Jádra byla profilována pomocí přístroje Chromium Controller (10X Genomics) podle protokolu výrobce.

Izolace jednotlivých buněk kosterního svalu

Svalová tkáň byla promyta v 1× PBS, očištěna od viditelných tukových usazenin a jemně rozemleta. Poté byly 2 g mleté tkáně přeneseny do rozkladného pufru 1 (750 U ml-1 kolagenázy typu 2 v 1× PBS) a inkubovány při 37 °C ve vodní lázni po dobu 90 minut. Částečně natrávená tkáň byla odebrána centrifugací (650 g, 5 min, 4 °C) a peleta byla resuspendována v trávicím pufru 2 (100 U ml-1 kolagenázy typu 2, 2 U ml-1 dispázy v PBS). Po 30 minutách inkubace při 37 °C ve vodní lázni bylo trávení zastaveno přidáním 2 % FBS. Buňky byly přefiltrovány přes 100 μm a 40 μm nylonové sítko (BD Falcon), shromážděny centrifugací (650 g, 4 °C, 3 min) a promyty 1× PBS, 2 % FBS. Následně byl pro čištění buněk použit 20% Percoll gradient (15 000 g, 4 °C, 20 min). Vrstva obsahující buňky byla sebrána, promyta v PBS obsahujícím 2 % FBS a životaschopné buňky byly spočítány vyloučením Trypanovy modři pomocí hemocytometru. Jádra byla profilována pomocí chromového kontroléru (10X Genomics) podle protokolu výrobce.

Tabulka klíčových zdrojů metod je v doplňkové tabulce 24.

Mapování transkriptomu

Po sekvenování byly vzorky demultiplexovány a uloženy jako soubory CRAM. Každý vzorek byl mapován na lidský referenční genom (GRCh38 v.3.0.0), který poskytla společnost 10X Genomics, a pomocí sady CellRanger (v.3.0.1) s výchozími parametry. Vzorky s jednou buňkou byly mapovány proti referenčnímu genu tak, jak byl poskytnut. Vzorky s jedním jádrem, reference pro pre-mRNA, byly vytvořeny pomocí pokynů společnosti 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references).

Zpracování dat o počtu

Po mapování byly vzorky z každého zdroje dat (jednojaderné, jednobuněčné a CD45+ buňky) seskupeny do jednotlivých objektů AnnData spojením raw_feature_bc_matrix_h5.h5 a přidáním příslušných informací o metadatech. Pro každý objekt zdroje dat byl vypočten průměr unikátních molekulárních identifikátorů (UMI) (n_counts) a použit jako práh pro prázdné kapénky.

Detekce dublet

Po odstranění prázdných kapének jsme použili scrublet73 k přiřazení skóre dublet (scrublet_score) každé buňce. Tyto buňky byly shlukovány a vizualizovány pomocí metody UMAP74. Kromě toho byla každá buňka zpracována pro detekci dublet pomocí perkolační metody, která umožňuje lepší detekci dublet75.

Kontrola kvality buněk a filtrování

Každý zdroj dat byl zpracován a anotován zvlášť, aby se zohlednily rozdíly v kvalitě specifické pro daný zdroj. Tyto metriky jsou zahrnuty jako kovariáty pro další zpracování. Celkové buňky a CD45+ buňky byly filtrovány pro počty (500 < n_counts <15 000), geny (200 < n_genes), mitochondriální geny (procento_mito <20 %), ribozomální geny (procento_ribo <20 %) a scrublet skóre (scrublet_score <0,3). Jednotlivá jádra byla filtrována pro počty (500 < n_counts <15 000), geny (300 < n_genes <6 000), mitochondriální geny (percent_mito <5 %), ribozomální geny (percent_ribo <5 %) a scrublet skóre (scrublet_score <0,3). Stejné prahové hodnoty pro filtrování byly použity na soubor údajů o kosterním svalstvu.

Scanpy toolkit 1.576 v Pythonu v.3.7 byl použit k provedení navazujících analýz, včetně normalizace (normalize_per_cell: counts_per_cell_after = 10 000), logaritmické transformace (log1p), detekce variabilních genů (highly_variable_genes), regrese nežádoucích zdrojů variability (regress_out: n_counts a percent_mito), škálování datových prvků (scale: max_value = 10) a PCA (pca: using highly variable genes), jak bylo popsáno dříve77.

Dávkové zarovnání pomocí hlubokého variačního autoenkodéru

Sestavili jsme globální manifold zarovnáním všech zdrojů dat a dárců v našich datech. To bylo provedeno postupem ve třech krocích: (1) Každý zdroj byl analyzován a anotován zvlášť, přičemž před dávkovým zarovnáním pomocí bbknn78 bylo provedeno zarovnání pouze pro dárce pomocí kroku lineární regrese v pericytovém prostoru. Diferenciálně exprimované geny (DEG) byly vypočteny pomocí Wilcoxonova rank sum testu s Bonferroniho-Hochbergovou úpravou, jak je implementováno v rámci Scanpy. (2) Pro anotaci každého klastru jsme použili integrativní přístup vyhledáváním nejvýznamnějších DEG (P < 1 × 10-5) s logFC >1 v databázích ToppFun79 a EnrichR80. Významné shody týkající se drah, transkripční regulace a biologických procesů byly upřednostněny pro anotaci daného klastru. Každý buněčný kompartment byl označen pod slotem adata.obs po seskupení buněčných stavů specifických pro zdroj. (3) Všechny zdroje byly sloučeny do jednoho objektu AnnData pod označením adata.obs. Dávky byly zarovnány pomocí funkce batch_correction z variačního autoenkodéru scGen81. Nejprve jsme zarovnali pro adata.obs, přičemž jsme použili adata.obs jako kotvu. Dále jsme zarovnali pro adata.obs s použitím adata.obs jako kotvy. Každé kolo dávkového zarovnávání probíhalo po dobu 50 epoch.

Touto metodou byly vytvořeny shluky pro adipocyty, cévní a imunitní srdeční populaci a také pro analýzu kosterního svalstva a přesnost shlukování byla vyhodnocena pomocí SCCAF82 (Extended Data Fig. 12d).

DEGs

Abychom si pomohli s anotací subpopulací jednotlivých buněčných kompartmentů, vypočítali jsme DEGs pomocí Wilcoxonova rank sum testu, jak je implementován v pracovním postupu scanpy a doporučen nedávnými srovnávacími studiemi83. Gen byl považován za diferenciálně exprimovaný, pokud měl log2-transformovanou fold change > 1 a P < 1 × 10-5, pokud není v části analýzy uvedeno jinak.

Buněčné interakce

Expresní matice studovaných populací byly exportovány z AnnData spolu s tabulkou metadat, která obsahovala kódy buněk jako indexy. Poté jsme spustili CellPhoneDB následujícím způsobem: cellphonedb method statistical_analysis meta.tsv counts.tsv-counts-data = gene_name-threads = 60. Surové předpovědi CellPhoneDB byly filtrovány odstraněním těch interakcí, jejichž P > 1,0 × 10-5 . Významné páry byly poté předloženy k analýze obohacení genové sady do ReactomeDB, enrichR a ToppFun pro funkční klasifikaci. Cévní buňky byly před analýzou náhodně podvzorkovány na 39 000 buněk a skupina pro opravu srdce (atriální a ventrikulární kardiomyocyty, FB a imunitní buňky) byla před analýzou náhodně podvzorkována na 69 295 buněk.

Vizualizace genové exprese na datech Visium společnosti 10X Genomics

Zpracovali jsme veřejně dostupná data Visium myokardu levé komory od společnosti 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.0.0/V1_Human_Heart) pomocí programu Scanpy v.1..5 upraveného pro analýzu dat 10X Genomics Visium (https://scanpy-tutorials.readthedocs.io/en/latest/spatial/basic-analysis.html). Stručně řečeno, byly odstraněny skvrny s méně než 500 UMI nebo více než 20 000 UMI a méně než 200 geny. Data byla před vykreslením logaritmicky transformována a normalizována.

Odhad rychlosti RNA

Pro výpočet rychlosti RNA jednotlivých buněk a jednotlivých buněk obohacených o CD45+ jsme použili výstupní soubor CellRanger BAM a soubor GENCODE v33 GTF (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz) spolu s velocyto84 CLI v.0.17.17 k vytvoření souboru loom obsahujícího kvantifikaci sestřihané a nesestřižené RNA. Poté jsme sestavili manifold, shlukovali buňky a vizualizovali rychlosti RNA pomocí scVelo85.

Subpopulační analýzy atriálních a ventrikulárních kardiomyocytů, fibroblastů a neuronálních buněk

Všechny čárové kódy označené v globálním objektu jako kardiomyocyty, fibroblasty a neuronální buňky byly vybrány pro další subpopulační analýzy. Další kritéria filtrování specifická pro buněčné populace byla použita pro jádra takto: počty kardiomyocytů (n_counts <12 500), geny (n_genes <4 000), mitochondriální geny (procento_mito <1 %), ribozomální geny (procento_ribo <1 %) a skóre scrublet (scrublet_score <0.25); FB mitochondriální geny (procent_mito <1 %), ribozomální geny (procent_ribo <1 %); geny neuronálních buněk (n_genes <4000), mitochondriální geny (procent_mito <1 %), ribozomální geny (procent_ribo <1 %). Celkové a CD45+ buňky byly v souborech dat o atriálních a ventrikulárních kardiomyocytech vyloučeny a nepřispěly k analýze subpopulací. Žádné další filtrování FB nebo celkových a CD45+ buněk neuronů nebylo použito. Kardiomyocyty a FB byly poté dále rozděleny do dvou skupin podle oblasti původu: (1) levá a pravá síň a (2) levá a pravá komora, hrot a interventrikulární septum.

Donorské efekty byly srovnány podle popisu v kroku (1) výše. Pro FB a neuronální buňky byly zdroje zarovnány, jak je popsáno v kroku (3) výše. Pro identifikaci subpopulací a vizualizaci86 bylo provedeno Leidenské shlukování a vizualizace UMAP. Diferenciálně exprimované geny byly vypočteny pomocí Wilcoxonova rank sum testu. Geny byly seřazeny podle skóre.

Křížové srovnání srdečních imunitních populací s imunitními populacemi kosterního svalu, ledvin a krve

Shromáždili jsme data jednobuněčného transkriptomu pro dospělé ledviny z ref. 99 (https://www.kidneycellatlas.org/) a provedli jsme subset všech imunitních buněk uvedených v jejich studii. Pro SKM jsme vybrali anotované imunitní buňky ze sloučeného souboru. Pro lidskou krev jsme použili veřejně dostupný soubor dat 10 000 jednotlivých buněk PBMC, který poskytla společnost 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/3.0.0/pbmc_10k_v3). Jak již bylo popsáno87 , natrénovali jsme logistický regresní model na srdečních imunitních buňkách s použitím 80 % expresních dat a otestovali jeho přesnost na zbývajících 20 %, čímž jsme získali model s přesností 0,6862 (Extended Data Obr. 8f, Doplňková tabulka 16). Tento model jsme poté použili k předpovědi analogických populací srdečních imunitních buněk v dospělé ledvině, SKM a PBMC. Předpovědi s pravděpodobností menší než 0,8 byly vyloučeny z následných srovnávacích analýz.

Analýza obohacení genové ontologie

Pro populaci komorových kardiomyocytů jsme použili balíček R gProfileR (https://cran.r-project.org/web/packages/gProfileR/index.html) se seznamem genů vCM4 s bodovým hodnocením jako vstupem a sadou genů exprimovaných v komorových kardiomyocytech jako pozadím (ty geny, které mají počet UMI >1). Pro provedení analýzy genové ontologie na cévních buňkách bylo 500 nejvýznamnějších DEG (P < 1 × 10-5) s logaritmicky transformovanou změnou záhybu >1 vyhledáno v databázi biologických procesů genové ontologie pomocí ToppFun79 (doplňková tabulka 25). Pro každou subpopulaci bylo vybráno pět nejvýznamněji obohacených termínů (q < 0,05), které byly vyneseny do tepelné mapy. Pro provedení analýzy drah na adipocytech bylo vyhledáno 500 nejvýznamnějších DEG (P < 1 × 10-5) s logaritmicky transformovanou změnou záhybu > 0,5 v databázi drah ToppFun79 (doplňková tabulka 26). Pro každou subpopulaci bylo vybráno pět nejvýznamněji obohacených drah (q < 0,05), které byly vyneseny do tepelné mapy.

Skóre souboru genů

Pro výpočet obohacení genů zapojených do dráhy onkostatinu M jsme použili funkci score_genes implementovanou v programu scanpy. Seznam genů byl shromážděn na základě rešerše literatury88,89. Pro obohacení sady genů byly uvažovány pouze vysoce exprimované geny, aby se snížil šum (více než 500 UMI ve všech buňkách). Stejná analýza byla provedena pro srovnání srdečních imunitních buněk v naší studii s pozorováními z předchozích studií o makrofázích s rezidencí v srdci51, myších makrofázích přetvářejících tkáň45 a původem z linie žloutkového váčku90.

Statistika a reprodukovatelnost

Všechny analýzy byly provedeny pomocí softwaru R, v.3.6.1. K porovnání rozložení buněčných typů na jednotlivých místech byly použity Studentovy t-testy. P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné. Lineární regresní modely (korelace) byly získány pomocí funkce R linear model (lm), která odhaduje statistickou pravděpodobnost (hodnotu P) lineárního vztahu. Pro vícenásobné testování byla použita Bonferroniho korekce.

Zobrazené mikrofotografie RNAscope na obrázcích jsou reprezentativní. Mikrofotografie na obr. 2g, 3c, h a v rozšířených datech obr. 3c (HAMP), v rozšířených datech obr. 3e (CNN1), v rozšířených datech obr. 4g, m, 6f byly opakovány s podobnými výsledky ve dvou jednotlivých řezech tkání. Mikrofotografie na obr. 2h, 3f a Extended Data obr. 3c (CNN1), Extended Data obr. 3e (PCDH7), Extended Data obr. 6e, h, 9d byly opakovány s podobnými výsledky ve třech jednotlivých řezech tkání. Mikrofotografie na obr. 1e, 2d, 3e a Extended Data obr. 1f, 3c (FHL1) a Extended Data obr. 6d byly opakovány s podobnými výsledky ve čtyřech jednotlivých řezech tkání. Mikrofotografie na obr. 2c a Extended Data obr. 3c (PRELID2), Extended Data obr. 10e, 12a byly opakovány s podobnými výsledky v šesti nebo více jednotlivých řezech tkáně. Pozitivní a negativní kontroly byly provedeny jednou u každého použitého vzorku.

Analýza obohacení GWAS

Stáhli jsme souhrnné statistiky GWAS z broad cvdi, katalogu EBI GWAS a atlasu GWAS. Vybrali jsme znaky s dobře posílenými GWAS (n > 5 000 a počet významných lokusů >10). Soubory dat GWAS jsou shrnuty v doplňkové tabulce 27. Údaje o genové expresi genů kódujících proteiny byly mapovány na ID genů Entrez a tyto genové anotace byly použity na sestavě lidského genomu hg19/37. Použili jsme pouze data genové exprese z jader. Dříve popsanou analýzu64 jsme implementovali v pythonu a v jazyce R. K výpočtu průměrných expresních profilů specifických pro jednotlivé buněčné typy jsme použili logaritmicky transformované počty (plus jeden pseudopočet). Pro každý typ buněk jsme provedli individuální magma analýzy, vždy s podmínkou výchozích kovariát na úrovni genů (např. délka genu) a průměrné exprese genů ve všech buňkách. Následně jsme použili Benjaminiho-Hochbergovu metodu a vybrali asociace znaků buněčného typu s FDR < 10 %. Tyto dvojice byly poté podrobeny podmíněné analýze, jak bylo popsáno dříve64 , aby byly definovány „nezávislé“, „společně vysvětlené“ a „částečně společně vysvětlené“ dvojice asociací (Doplňková tabulka 28).

Distribuce rozptýlených buněk a izolovaných jader

Různé postupy pro získání izolovaných jader a rozptýlených buněk vedly k výrazně odlišným distribucím buněčných typů (Doplňková tabulka 29, Extended Data Fig. 2). Pozoruhodné je, že 30,1 % a 49,2 % izolovaných jader pocházelo z atriálních a ventrikulárních kardiomyocytů v atriální a ventrikulární oblasti, zatímco tyto buňky byly většinou vyloučeny z preparátů izolovaných a CD45-selektovaných buněk (Doplňková tabulka 2)

Vyloučením kardiomyocytů zůstalo rozložení buněčných typů identifikovaných z izolovaných jader a disperzních buněk odlišné (Doplňková tabulka 30). Ačkoli 59,0 % disperzních buněk tvořily EC, pouze 15,7 % jader pocházelo z EC. Naopak 64,2 % jader pocházelo z FB (31,2 %) a pericytů (33,0 %), zatímco pouze 17,1 % dispergovaných buněk bylo z FB (2,3 %) a pericytů (14,8 %). Tyto rozdíly mohou odrážet citlivost jader EC na izolační postupy nebo odolnost pericytů a FB vůči enzymatickému štěpení buněk.

Přes rozdíly v distribuci buněk mezi izolovanými jádry a disperzními buňkami byly profily genové exprese buněčných linií přiměřeně korelované (r > 0,4 pro každý typ buněk). Abychom se zabývali shodou genů zachycených buňkami a jádry, porovnali jsme expresi hlavních markerů buněčných typů z obr. 1c ve všech třech zdrojích (Extended Data Fig. 1c). Jelikož jádra postrádají cytoplazmatickou RNA, exprese některých genů, zejména imunitních genů NKG7 a C1QA, byla v jádrech nižší než v buňkách. Nicméně obecný trend, pokud jde o markerové geny, byl konzistentní napříč všemi třemi zdroji a stejné geny odlišovaly jednotlivé typy buněk nezávisle na zdroji.

Další analýza cévních buněk

Skupina PC3_str obsahovala podobný podíl buněk a jader a měla scrubletovo skóre pod použitým přísným prahem; nicméně průměrný počet genů a počty v tomto shluku byly nadprůměrné. I přes naše přísné filtrování kvality tedy nemůžeme vyloučit, že se v tomto shluku mohou vyskytovat dublety. EC10_CMC-like a PC4_CMC-like koexprimují geny EC nebo pericytů s markery kardiomyocytů a je třeba dalších studií, abychom pochopili, zda představují dosud neznámé buněčné stavy nebo dublety.

Pozorování arteriálních a venózních SMC podporují předchozí studie, které předpokládají, že arteriální SMC jsou více kontraktilní a venózní SMC jsou méně diferencované91.

EC3_cap obohacují transkripty kódující složky AP1 (JUN a FOS), které zprostředkovávají četná rozhodnutí o osudu EC, včetně odpovědi na VEGF, zánětlivé a stresové signály, a ATF3, gen adaptivní odpovědi indukovaný různými signály92,93,94 .

Charakterizace kosterního svalu

Od pěti zdravých jedinců, včetně jednoho dárce s odpovídající srdeční tkání, jsme odebrali vzorky mezižeberního kosterního svalu a profilovali transkriptom 35 665 jednotlivých buněk a 39 597 jednotlivých jader. Analogicky k srdci nám kombinace buněk a jader umožnila zachytit a rozlišit hlavní buněčné linie, včetně kardiomyocytů, fibroblastů, endoteliálních buněk, buněk hladkého svalstva, pericytů, myeloidních a lymfoidních imunitních buněk a satelitních buněk (Extended Data Fig. 11a, b, Supplementary Table 31).

Další analýza cévních buněk kosterního svalu identifikovala deset odlišných populací. Endotelové buňky vykazovaly pět shluků oddělených na základě příslušných cévních lůžek se znaky podobnými těm, které pozorujeme v srdci. EC_cap exprimuje VWF a RGCC. Venózní EC_ven exprimují ACKR1 a PLVAP, zatímco arteriální EC_art vykazují SEMA3G a HEY1, což je v souladu s našimi údaji o srdci (Extended Data Obr. 11c, d, Doplňková tabulka 32).

Celkové rozložení populací cévních a stromálních buněk v kosterním a srdečním svalu bylo podobné, včetně arteriálních a venózních znaků EC; kosterní sval však obsahoval jediný klastr SMC, což potenciálně souvisí s menší velikostí souboru dat. V kosterním svalu zahrnovaly předpokládané interakce mezi buňkami EC_art a SMC NOTCH1/4-JAG1 i JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH3, nikoli však JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH2, odvozené v srdci (Extended Data Fig. 11e, f, Supplementary Table 33).

Kardiální imunitní buňky

Pomocí logistického regresního modelu jsme neidentifikovali žádný protějšek srdečních IL17RA+ monocytů v SKM nebo ledvinách, pravděpodobně v důsledku malé velikosti této populace.

Identifikované naivní T-buňky (CD4+T_naive) exprimovaly CCR7 a SELL, což svědčí o jejich naivní a tkáňově rezidentní povaze95. Paměťové T buňky (CD8+T_tem) exprimovaly BACH2, STAT4 a IL7R, což je spojeno s dlouhodobou imunitní pamětí96,97 . Lymfoidní buňky jsme dále charakterizovali pomocí scNym98 a vycvičili jsme je na základě publikovaných údajů99,100. Výsledný model byl aplikován na naše srdeční imunitní buňky a ty buňky, u nichž bylo předpovězeno skóre vyšší než 0,8, byly považovány za pravděpodobné kandidáty na reanotaci. Pomocí tohoto přístupu jsme identifikovali kandidáty na plazmatické B buňky (109), dendritické buňky (645), vrozené lymfoidní buňky (89), MAIT T buňky (219), T pomocné buňky (80) T regulační buňky (11), T centrální paměťové buňky (103), γδ T buňky (30) a plazmocytoidní dendritické buňky (27). Tyto anotace lze nalézt v anotacích kardiálních imunitních objektů pod označením „scNym“ na adrese www.heartcellatlas.org.

Souhrn zpráv

Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary, která je propojena s tímto článkem.