2 Fyziologické důkazy o endozepinech
Syntéza RO 15-1788 (neboli flumazenilu, FLZ), prvního známého antagonisty BZ (Hunkeler et al., 1981; Ramerstorfer, Furtmüller, Vogel, Huck, & Sieghart, 2010) usnadnila rozsáhlý výzkum podporující hypotézu, že endogenní ligandy do vazebného místa BZ existují a jsou funkčně relevantní in vitro a in vivo. Ačkoli byl FLZ cenným nástrojem pro identifikaci fyziologických účinků BZ, jeho použití pro tento účel má svá omezení. Bylo například prokázáno, že FLZ může mít u heterologně exprimovaných GABAAR účinky PAM, zejména při vysokých koncentracích (Ramerstorfer et al., 2010). Důležité je, že nikdy nebylo prokázáno, že by FLZ měl NAM účinky na heterologně exprimované GABAAR, což naznačuje, že jakékoli NAM účinky FLZ na inhibici zprostředkovanou GABA jsou s největší pravděpodobností způsobeny antagonismem endogenního ligandu.
Studie in vitro naznačují řadu okruhů, ve kterých jsou endozepiny konstitutivně exprimovány a fyziologicky aktivní, což dokazují potlačující účinky FLZ na inhibici zprostředkovanou GABA, především prostřednictvím snížení trvání odpovědi. FLZ například potlačuje IPSP(C) v hipokampu (King, Knox, Dingledine, 1985; Krespan, Springfield, Haas, & Geller, 1984) a v neokortikálních neuronálních kulturách (Vicini et al., 1986). Bylo prokázáno, že FLZ potlačuje inhibici v granulárních buňkách dentátového gyru v pilokarpinovém modelu epilepsie temporálního laloku (Leroy, Poisbeau, Keller, & Nehlig, 2004) a potlačuje inhibici v neokortikálních pyramidových neuronech vrstvy II/III (Ali & Thomson, 2008). Dlouhodobá potenciace inhibičních synapsí v hipokampální oblasti CA1 byla spojena se zvýšením amplitudy IPSC, která byla potlačena FLZ (Xu & Sastry, 2005). Nejnověji se ukázalo, že FLZ potlačuje synaptickou inhibici neuronů thalamického retikulárního jádra (nRt, Christian et al., 2013), což naznačuje přítomnost endozepinu v tomto jádře. Dohromady tyto studie s FLZ silně podporují přítomnost endogenní aktivity PAM v několika odlišných oblastech mozku, což naznačuje, že se jedná o široce uplatňovaný endogenní modulační mechanismus v CNS.
S antagonismem endozepinové funkce FLZ je v souladu řada zajímavých klinických nálezů. Například léčba FLZ může vyvolat záchvaty paniky u pacientů s panickou poruchou, ale ne u zdravých kontrol (Nutt, Glue, Lawson, & Wilson, 1990). Může také precipitovat větší panickou reakci u žen s premenstruační dysforickou poruchou ve srovnání s kontrolami (Le Mellédo, Van Driel, Coupland, Lott, & Jhangri, 2000) a zvrátit stupor spojený s jaterní encefalopatií (Als-Nielsen, Gluud, & Gluud, 2004; Baraldi et al., 2009). Tyto studie společně naznačují fyziologickou roli akumulace endozepinů v extracelulárním prostoru, tj. fyziologické hromadění, při regulaci úzkosti/paniky. Kromě toho bylo zjištěno, že sérové hladiny látek, které inhibují vazbu FLZ na mozkové membrány potkanů, se během porodu spontánním porodem zvýšily dvojnásobně, což je účinek, který nebyl pozorován u pacientek podstupujících císařský řez (Facchinetti, Avallone, Modugno, & Baraldi, 2006), což naznačuje, že fyziologické stavy, jako je porod, mohou způsobovat hromadění endozepinů.
Význam těchto zjištění pro lidské pacienty s epilepsií zůstává prozatím neznámý, protože důkazy o působení endozepinů u pacientů s epilepsií nejsou jednoznačné. FLZ může u pacientů vyvolat záchvaty, ale přinejmenším někteří pacienti byli pravděpodobně léčeni BZ (Spivey, 1992). Například v sérii 67 pacientů, kteří podstoupili hodnocení před operací epilepsie (Schulze-Bonhage & Elger, 2000), byly záchvaty vyvolány u 8 (12 %) – všichni byli dříve léčeni BZ. Kazuistiky naznačují zhoršení záchvatů vlivem FLZ u kojenců a u starších osob (McDuffee & Tobias, 1995; Thomas, Lebrun, & Chatel, 1993). Hlášené účinky FLZ na záchvaty ve studiích na zvířatech jsou rovněž nejednotné. U potkanů mladších než 2 týdny FLZ zhoršuje drobné motorické záchvaty vyvolané PTZ (Rathouská, Kubová, Mares, & Vorlíček, 1993). Pozoruhodné je, že u modelů s vysokými dávkami konvulzivních látek bylo zaznamenáno buď potlačení záchvatové aktivity (Kaijima, Le Gal La Salle, & Rossier, 1983), nebo žádný účinek (Hunkeler et al., 1981). V modelu GAERS genetické spontánní epilepsie absence měl FLZ účinky závislé na koncentraci, přičemž nízké dávky potlačovaly výboje hrotových vln (SWD) a vyšší dávky je zesilovaly (Marescaux et al., 1984). Kromě toho bylo prokázáno, že genetická mutace (R43Q) v lidské podjednotce γ2 spojená s familiárními absencemi i febrilními záchvaty ruší (Wallace et al., 2001) nebo snižuje (Bowser et al., 2002) in vitro citlivost specifických GABAAR na DZP. Mechanismus zvýšené záchvatové aktivity související s necitlivostí receptorů na exogenní ligand DZP není dosud znám. Jednou z provokativních hypotéz je, že mutace způsobuje necitlivost receptorů na přirozeně se vyskytující endogenní BZ. Vzhledem k tomu, že endogenní BZ by pravděpodobně měl antiseptické vlastnosti, očekávalo by se, že mutace v receptoru, které brání vazbě endogenního BZ, budou způsobovat záchvaty. Obchodování s receptory je však touto mutací také ovlivněno (Kang & Macdonald, 2004; Sancar & Czajkowski, 2004) a mohlo by přispívat k záchvatové aktivitě, takže úloha endozepinů u záchvatů souvisejících s mutací γ2R43Q zůstává sporná.
FLZ také údajně zvrátil idiopatický rekurentní stupor (Rothstein et al..), 1992), ačkoli v posledních letech se ukázalo, že přinejmenším někteří pacienti, kteří reagovali na FLZ, užívali BZ skrytě (Granot, Berkovic, Patterson, Hopwood, & Mackenzie, 2004) a tato oblast zůstává kontroverzní (Cortelli et al., 2005). V nedávné studii FLZ normalizoval vigilitu u dobře charakterizované skupiny pacientů s hypersomnií. V mozkomíšním moku (CSF) těchto pacientů byla zjištěna peptidergní aktivita PAM (Rye et al., 2012). PAM však neinteragovala s potenciací BZ midazolamem a částečně přetrvávala u α1(H101R), GABAAR s bodovou mutací, která je činí necitlivými na BZ, což naznačuje, že nemusí jít o klasický BZ-mimikant (Rye et al., 2012). Identita tohoto CSF PAM a jeho role v patofyziologii hypersomnie zůstává neznámá.