RuBisCO

RuBisCO är ett av många enzymer i Calvincykeln. När Rubisco underlättar angreppet av CO2 på C2-kolämnet i RuBP och den efterföljande bindningsklyvningen mellan C3- och C2-kolämnet bildas 2 molekyler glycerat-3-fosfat. Omvandlingen omfattar dessa steg: enolisering, karboxylering, hydrering, klyvning av C-C-bindningar och protonering.

SubstratEdit

Substrat för RuBisCO är ribulos-1,5-bisfosfat och koldioxid (till skillnad från den ”aktiverande” koldioxiden). RuBisCO katalyserar också en reaktion av ribulos-1,5-bisfosfat och molekylärt syre (O
2) i stället för koldioxid (CO
2).Att skilja mellan substraten CO2 och O2 tillskrivs de olika interaktionerna mellan substratets kvadrupolmoment och en hög elektrostatisk fältgradient. Denna gradient etableras av dimerformen av den minimalt aktiva RuBisCO, som med sina två komponenter ger en kombination av motsatt laddade domäner som krävs för enzymets interaktion med O2 och CO
2. Dessa förhållanden bidrar till att förklara den låga omsättningshastigheten hos RuBisCO: För att öka styrkan i det elektriska fält som krävs för tillräcklig interaktion med substratens kvadrupolmoment måste enzymets C- och N-terminalsegment stängas av, vilket gör det möjligt att isolera den aktiva platsen från lösningsmedlet och sänka den dielektriska konstanten. Denna isolering har en betydande entropisk kostnad och resulterar i den dåliga omsättningshastigheten.

Bindning RuBPEdit

Carbamylering av ε-aminogruppen i Lys201 stabiliseras genom samordning med Mg2+. Denna reaktion inbegriper bindning av karboxylatterminerna av Asp203 och Glu204 till Mg2+-jonen. Substratet RuBP binder Mg2+ och förskjuter två av de tre akvoliganderna.

EnoliseringEdit

Enolisering av RuBP är omvandlingen av RuBP:s ketotautomer till en enediol(ate). Enoliseringen inleds genom deprotonering vid C3. Enzymbasen i detta steg har diskuterats, men de steriska begränsningar som observerats i kristallstrukturer har gjort Lys201 till den mest sannolika kandidaten. Det karbamatsyre på Lys201 som inte är koordinerat med Mg-jonen deprotonerar C3-kolämnet i RuBP för att bilda ett 2,3-enediolat.

KarboxyleringEdit

Karboxylering av 2,3-enediolatet resulterar i intermediären 3-keto-2′-carboxyarabinitol-1,5-bisfosfat och Lys334 är placerad för att underlätta tillsättningen av CO2-substratet eftersom det ersätter den tredje Mg2+-koordinerade vattenmolekylen och addera direkt till enediolen. Inget Michaelis-komplex bildas i denna process. Hydrering av denna keton resulterar i en ytterligare hydroxygrupp på C3, vilket bildar en gem-diolintermediär. Karboxylering och hydrering har föreslagits antingen som ett enda samordnat steg eller som två sekventiella steg. Den samordnade mekanismen stöds av vattenmolekylens närhet till C3 i RuBP i flera kristallstrukturer. Inom spenatstrukturen är andra rester väl placerade för att hjälpa till i hydreringssteget eftersom de befinner sig inom vätebindningsavstånd till vattenmolekylen.

C-C-bindningsklyvningRedigera

Gem-diolintermediären klyvs vid C2-C3-bindningen för att bilda en molekyl av glycerat-3-fosfat och en negativt laddad karboxylat. Stereospecifik protonering av C2 i denna karbanion resulterar i ytterligare en molekyl glycerat-3-fosfat. Detta steg tros underlättas av Lys175 eller eventuellt det karbamylerade Lys201.

ProductsEdit

När koldioxid är substratet är karboxylasreaktionens produkt en instabil fosforylerad intermediär med sex kol som är känd som 3-keto-2-carboxyarabinitol-1,5-bisfosfat, som snabbt sönderfaller till två molekyler glycerat-3-fosfat. 3-fosfoglyceratet kan användas för att producera större molekyler, t.ex. glukos.

Rubiscos sidoaktiviteter kan leda till onyttiga eller hämmande biprodukter; en sådan produkt är xylulos-1,5-bisfosfat, som hämmar Rubiscoaktiviteten.

När molekylärt syre är substratet är produkterna från oxygenasreaktionen fosfoglykolat och 3-fosfoglycerat. Fosfoglykolat återvinns genom en sekvens av reaktioner som kallas fotorespiration och som involverar enzymer och cytokromer som finns i mitokondrier och peroxisomer (detta är ett fall av metabolitreparation). I denna process omvandlas två molekyler fosfoglykolat till en molekyl koldioxid och en molekyl 3-fosfoglycerat, som kan återgå till Calvincykeln. En del av det fosfoglykolat som går in i denna väg kan behållas av växterna för att producera andra molekyler, t.ex. glycin. Vid omgivande nivåer av koldioxid och syre är förhållandet mellan reaktionerna ungefär 4 till 1, vilket resulterar i en nettofixering av koldioxid på endast 3,5. Enzymmets oförmåga att förhindra reaktionen med syre minskar alltså kraftigt den fotosyntetiska kapaciteten hos många växter. Vissa växter, många alger och fotosyntetiska bakterier har övervunnit denna begränsning genom att utforma metoder för att öka koncentrationen av koldioxid runt enzymet, bland annat C4-kolfixering, crassulaceanernas syrametabolism och användning av pyrenoid.

Hastigheten för enzymatisk aktivitetRedigera

Vissa enzymer kan utföra tusentals kemiska reaktioner varje sekund. RuBisCO är dock långsam och fixerar endast 3-10 koldioxidmolekyler varje sekund per enzymmolekyl. Den reaktion som katalyseras av RuBisCO är således den primära hastighetsbegränsande faktorn i Calvincykeln under dagen. Under de flesta förhållanden, och när ljuset inte på annat sätt begränsar fotosyntesen, reagerar dock hastigheten hos RuBisCO positivt på ökande koldioxidkoncentration.

RuBisCO är vanligtvis bara aktiv under dagen, eftersom ribulos 1,5-bisfosfat inte regenereras i mörkret. Detta beror på regleringen av flera andra enzymer i Calvincykeln. Dessutom samordnas aktiviteten hos RuBisCO med aktiviteten hos de andra enzymerna i Calvincykeln på flera andra sätt:

Genom jonerEdit

När kloroplasterna belyses stiger pH-värdet i stroma från 7,0 till 8,0 på grund av den protongradient (vätejon, H+
) som skapas över thylakoidmembranet. Protonernas rörelse in i thylakoiderna drivs av ljuset och är grundläggande för ATP-syntesen i kloroplasterna (Vidare läsning: Fotosyntetiskt reaktionscentrum; Ljusberoende reaktioner). För att balansera jonpotentialen över membranet rör sig magnesiumjoner (Mg2+
) ut ur thylakoiderna som svar på detta, vilket ökar koncentrationen av magnesium i kloroplasternas stroma. RuBisCO har ett högt optimalt pH (kan vara >9,0, beroende på magnesiumjonkoncentrationen) och blir därför ”aktiverad” genom att koldioxid och magnesium förs in i de aktiva platserna enligt beskrivningen ovan.

Genom RuBisCO-aktivasEdit

I växter och vissa alger krävs ett annat enzym, RuBisCO-aktivas (Rca, GO:0046863, P10896), för att möjliggöra en snabb bildning av den kritiska karbamaten i den aktiva platsen för RuBisCO. Detta krävs eftersom ribulos 1,5-bisfosfat (RuBP) binder starkare till RuBisCO:s aktiva platser när det finns överskott av karbamat, vilket hindrar processerna från att gå framåt. I ljuset främjar RuBisCO-aktivaset frigörandet av det hämmande (eller – enligt vissa synsätt – lagrande) RuBP från RuBisCO:s katalytiska platser. Aktivas krävs också i vissa växter (t.ex. tobak och många bönor) eftersom RuBisCO i mörker hämmas (eller skyddas från hydrolys) av en kompetitiv hämmare som syntetiseras av dessa växter, en substratanalog 2-Carboxy-D-arabitinol 1-fosfat (CA1P). CA1P binder tätt till den aktiva platsen för karbamylerad RuBisCO och hämmar den katalytiska aktiviteten i ännu högre grad. CA1P har också visat sig hålla RuBisCO i en konformation som är skyddad från proteolys. I ljuset främjar RuBisCO-aktivaset också frigörandet av CA1P från de katalytiska platserna. Efter att CA1P frigjorts från RuBisCO omvandlas det snabbt till en icke-hämmande form av ett ljusaktiverat CA1P-fosfatas. Även utan dessa starka hämmare fullbordas inte de normala reaktionerna med koldioxid eller syre en gång per flera hundra reaktioner; andra hämmande substratanaloger bildas fortfarande i den aktiva platsen. Återigen kan RuBisCO-aktivas främja frigörandet av dessa analoger från de katalytiska platserna och bibehålla enzymet i en katalytiskt aktiv form. Vid höga temperaturer aggregerar dock RuBisCO-aktivaset och kan inte längre aktivera RuBisCO. Detta bidrar till den minskade karboxyleringskapaciteten som observeras under värmestress.

Genom ATP/ADP och stromalt reduktions-/oxidationstillstånd genom aktivasetRedigera

För att aktivaset ska kunna avlägsna det inhiberande RuBP, CA1P och de andra inhiberande substratanalogerna krävs att ATP förbrukas. Denna reaktion hämmas av närvaron av ADP, och därmed beror aktivasaktiviteten på förhållandet mellan dessa föreningar i kloroplaststroma. I de flesta växter modifieras dessutom aktivasets känslighet för förhållandet ATP/ADP av stromats reduktions/oxidationstillstånd (redox) genom ett annat litet reglerande protein, thioredoxin. På detta sätt kan aktivasets aktivitet och aktiveringstillståndet hos RuBisCO moduleras som svar på ljusintensiteten och därmed bildningshastigheten för ribulos 1,5-bisfosfat-substratet.

Genom fosfatEdit

I cyanobakterier deltar även oorganiskt fosfat (Pi) i den samordnade regleringen av fotosyntesen: Pi binder till RuBisCO:s aktiva plats och till en annan plats på den stora kedjan där det kan påverka övergångarna mellan aktiverade och mindre aktiva konformationer av enzymet. På detta sätt kan aktivering av bakteriell RuBisCO vara särskilt känslig för Pi-nivåer, vilket kan få den att agera på ett liknande sätt som hur RuBisCO-aktivas fungerar i högre växter.

Genom koldioxidRedigera

Då koldioxid och syre konkurrerar vid RuBisCO:s aktiva plats kan kolfixering av RuBisCO förstärkas genom att öka koldioxidhalten i den avdelning som innehåller RuBisCO (kloroplaststroma). Flera gånger under växternas utveckling har mekanismer utvecklats för att öka koldioxidhalten i stroma (se C4-kolfixering). Användningen av syre som substrat verkar vara en förbryllande process, eftersom den verkar kasta bort fångad energi. Det kan dock vara en mekanism för att förhindra överbelastning av kolhydrater under perioder med högt ljusflöde. Denna svaghet i enzymet är orsaken till fotorespiration, så att friska blad i starkt ljus kan ha noll nettokolfixering av kol när förhållandet mellan O
2 och CO
2 som är tillgängligt för RuBisCO skiftar för mycket i riktning mot syre. Detta fenomen är främst temperaturberoende: Höga temperaturer kan minska koncentrationen av CO
2 löst i bladvävnadernas fukt. Detta fenomen är också relaterat till vattenstress: Eftersom växternas blad kyls genom avdunstning orsakar begränsat vatten höga bladtemperaturer. C4-växter använder först enzymet PEP-karboxylas, som har en högre affinitet för CO
2. Processen skapar först en 4-kolig intermediär förening, som transporteras till en plats i C3-fotosyntesen och sedan avkarboxyleras, varvid CO
2 frigörs för att öka koncentrationen av CO
2, därav namnet C4-växter.

Crassulaceansyrametabolism (CAM) växter håller sina klyvöppningar stängda under dagen, vilket sparar vatten men hindrar de ljusoberoende reaktionerna (även kallade Calvincykeln) från att äga rum, eftersom dessa reaktioner kräver att CO
2 passerar genom gasutbyte genom dessa öppningar. Avdunstning genom bladets ovansida förhindras av ett lager vax.