Resultat och diskussion
VARV Genome Stability and Phylogenetic Analysis.
För den evolutionära studien av VARV (4) användes tillgängligheten av genomsekvenser från en samling VARV-isolat med en bred geografisk spridning (Fig. 1). VARV, som tillhör släktet Orthopoxvirus, innehåller ett enda linjärt dubbelsträngat DNA-genom på 186 kb som kodar för de flesta enzymer för dess förökning (5). De studerade VARV-isolaten uppvisade en låg mutationsfrekvens eftersom epidemiologiskt kopplade isolat uppvisade små eller inga sekvensförändringar i prover med insamlingstider med upp till ett års mellanrum . Denna låga mutationsfrekvens kan tydligt ses i våra genetiskt identiska prover från Bangladesh som samlades in mellan 1974 och 1975. Dessa prover representerar säkert långa komplexa överföringskedjor från en av de mest tätbefolkade regionerna i världen, men de har identiska eller nästan identiska nukleotidsekvenser. Det besläktade Orthopoxvirus monkeypoxvirus uppvisar på samma sätt enstaka eller inga nukleotidförändringar bland isolat från tre olika värdar i ett nyligen inträffat utbrott i USA (6). Inom och mellan arter av ortopoxvirus har genomerna nukleotididentiteter på >99,6 % bland VARV-isolat och 98 % bland VARV och släktingar som taterapoxvirus (TATV) (4) (Västafrika) och kamelpoxvirus (CMLV) (7) (Centralasien) (tabell 1), de två arter som har störst sekvenslikhet med VARV (4). Den stora storleken och den långsamma nukleotidersättningshastigheten gör det möjligt för VARV:s genomiska DNA att behålla fylogenetiskt informativa mutationer samtidigt som förekomsten av homoplastiska mutationer minskar (dvs. färre karaktärsstatsomvandlingar). Mångfalden hos 47 nyligen sekvenserade VARV-genom var till stor del förknippad med isolatens geografiska ursprung (ref. 4 och den här studien), och mutationerna hade minimal koppling till den tidsmässiga variationen mellan isolaten. Dessa observationer visar att det inte fanns en enda pandemisk stam ( SI Text , not 1) utan snarare att de genetiska kladerna i dessa analyser är representativa för gamla och kanske gamla lokalt endemiska stammar.
Hypoteser om VARV:s ursprung. Händelse 0, Den stora likheten mellan VARV och CMLV:s och TATV:s genomsekvenser tyder på att TATV och CMLV har en nyare gemensam förfader med VARV än andra kända arter av ortopoxvirus. Händelse 1, hypotes A: Ett ursprungligt VARV har delats upp i två primära klasser (P-I och P-II) och har utvecklats oberoende av varandra i den gamla och den nya världen genom att följa sina mänskliga värdar. Händelse 1, hypotes B: Divergens mellan P-I/P-II i Afrika. Händelse 2, hypoteser A och B: Den långa enskilda grenen och den efterföljande utstrålningen av P-I tyder på att den ursprungliga VARV-varianten i P-I troligen har sitt ursprung i nordöstra Asien och att de endemiska smittkopporna i P-I började spridas till Östasien, Mellanöstern och Indien när de lokala befolkningarna blev tillräckligt stora. Händelse 2a, P-I:s diversifiering och migration i hela Asien. Händelse 2b, västerländsk utforskning förde VARV major till Sydafrika från den indiska subkontinenten, som sedan spred sig norrut till Centralafrika och Afrikas horn (Somaliska halvön). Händelse 3 och 4, hypotes A: diversifiering av P-II i Nya världen följt av dess återintroduktion i Afrika, hypotes B: Om P-I-strålningen representerar den endemiska historien för smittkoppor i den gamla världen, förklarar det den historiska gåtan med avsaknaden av en beskrivning av smittkoppor i litteraturen från de gamla grekiska och romerska civilisationerna (1). Det är troligt att smittkoppsepidemierna i denna region inträffade vid en senare tidpunkt än de som inträffade i det gamla Kina och Indien. ”Atenpesten” 430 f.Kr. som beskrivs av Thukydides och som en gång ansågs vara smittkoppor (3) skulle motsäga denna teori, men det har nyligen fastställts att det rörde sig om tyfus (25). Under Ramses V:s regeringstid befann sig Egypten i ett inbördeskrig och attackerades av fiender från norr (3); om Ramses V:s pustulösa utbrott berodde på smittkoppor skulle det kunna representera ett smittkoppsutbrott från importerade fall på grund av kriget snarare än en regional endemisk sjukdom. Denna hypotes stöds av det faktum att endast tre mumier under den perioden hade liknande lesioner (2).
Diversifiering av alastrim minor.
De smittkoppshistoriska/VARV-topologibaserade analyserna visar att divergensen mellan alastrim minor och västafrikansk variola började för minst 800 år sedan (tabell 2 och SI-tabell 4), vilket föregår den tidigare hypotesen om att divergensen sammanfaller med början av slavhandeln. Enligt den äldre ursprungshypotesen kan denna divergens ha inträffat efter en artbildningshändelse i antingen Nya världen (baserat på kalibreringen från de tidigaste historiska registren över smittkoppor; fig. 3 A) eller Västafrika (baserat på kalibreringen från de sydafrikanska historiska registren över smittkoppor; fig. 3 B). Dessa scenarier tyder på att det fanns oidentifierade isolat av variola minor/alastrim som fanns i antingen Afrika eller Nya världen mycket tidigare än upptäckten av alastrim minor (P-II); detta taxon har alltså en längre historia än vad som har beskrivits.
Och även om den väldokumenterade importen av VARV major till Amerika hade en förödande effekt på många av de infödda befolkningarna (2) kan den snabba sjukdomsspridningen med stor dödlighet delvis bero på den kombinerade effekten av den höga befolkningstätheten, avsaknaden av grundläggande vård för offren och potentiella infektioner med andra sjukdomar från den gamla världen (26, 27). Historiskt sett finns det få uppgifter om smittkoppor i Västafrika, och Henige (28) hävdade att det första VARV stora smittkoppsutbrottet i Nya världen inte hade sitt ursprung i Västafrika, vilket skulle motbevisa hypotesen om en tidig smittkoppshistoria i Västafrika. Det är möjligt att alastrim efter en gammal introduktion har utvecklats oberoende av varandra i isolerade regioner inom den Nya världens stora geografiska område. Faktum är att Phelans studie visade att de infödda populationerna på Ecuadors högland inte minskade under det första spanska styret (som tillskrivs ha introducerat VARV major i Nya världen) (29), vilket tyder på att dessa populationer kan ha varit mer motståndskraftiga mot smittkoppor, kanske genom tidigare kontakt med alastrim. I Trinidad dokumenterades ett milt utbrott av smittkoppor 1902 som hade sitt ursprung i denna region (30). Om denna diversifiering inträffade i Nya världen skulle den primära isoleringshändelsen sannolikt ha varit ett resultat av att ett förfäder-VARV med tidiga människor förflyttades till den regionen (Fig. 4A). Avsaknaden av SNP-signaturer som tyder på blandning mellan P-I och P-II (SI fig. 6 och 7), de konsekventa och signifikant annorlunda kliniska egenskaperna hos alastrim från traditionella VARV major av P-I (31), skulle kunna förklaras av en sådan betydande geografisk separation.
Om splittringen av P-I/P-II inträffade inom den gamla världen, har P-II sannolikt sitt ursprung i Västafrika. De två P-II-subkladerna skulle då ha divergerat ≈800-1 100 YBP (tabell 2 och SI-tabell 4) på den afrikanska kontinenten. Den geografiska fördelningen av dessa händelser är svår att fastställa på grund av bristen på skriftlig historia i dessa regioner. Förekomsten och diversifieringen av andra närbesläktade ortopoxvirus som apkoppor och TATV skulle dock kunna stödja ett afrikanskt ursprung för förfädernas VARV:er. Om isoleringen och diversifieringen av P-II skedde i Afrika finns det, baserat på vår fylogeni, en obeskriven afrikansk representant från P-II-subklassen, som introducerades i den nya världen kanske hundratals år efter diversifieringshändelsen, möjligen under tiden för slavhandeln mellan länder i den gamla och den nya världen (Fig. 3 B).
En otillräcklig förståelse av dessa kulturers historia och de relativt mildare kliniska symptomen (i förhållande till variola major) bidrar till avsaknaden av ett mer omfattande historiskt register över smittkoppssjukdomar i antingen Nya världen eller Afrika söder om Sahara. Den historiska befolkningstätheten i båda dessa regioner var lägre än i de regioner där variola major är endemisk. I fall av mildare sjukdom skulle individer ha varit mer rörliga när de var smittsamma och skulle ha haft ett större antal kontakter och på så sätt ha vidmakthållit sjukdomens spridning. Till stöd för denna hypotes kan nämnas att de milda smittkoppsutbrotten i Somalia kvarstod under långa perioder bland små nomadiska grupper och uppvisade ett betydligt annorlunda överföringsmönster jämfört med det som gällde för VARV major (2). Även om det är okänt om variolering/inokulering användes av ursprungsbefolkningen i Afrika eller Amerika, skulle VARV:s långa livslängd i konvalescenta skorv (upp till ett decennium) (32-34) utgöra ytterligare en mekanism för upprepad introduktion av en smittkoppsstam i ett geografiskt samhälle, antingen genom oavsiktlig kontakt med skorvmaterial eller direkt genom varioleringspraxis.
VARV:s ursprung.
Möjliga ledtrådar om VARV:s anpassning till människor kan hittas i det nära förhållandet mellan VARV och TATV/CMLV (4). TATV är förknippat med en landlevande gnagare som är infödd i Västafrika (35). Våra koalescensanalyser visar att divergensen mellan VARV och TATV inträffade från 16 000 YBP (tabell 2 och SI Dataset 4, baserat på de smittkoppshistoriska uppgifterna i Sydafrika) till 68 000 YBP (tabell 2 och SI Dataset 3, baserat på den tidigaste registrerade smittkoppshistorien i Östasien). I likhet med de besläktade zoonotiska ortopoxvirusen med reservoarer hos gnagare (6, 36, 37) kan VARV således ha utvecklats från en enzootisk patogen hos afrikanska gnagare och därefter spridits utanför Afrika.
Den genomiska sekvensen hos de VARV-isolat som valts ut för den här studien hämtades från Världshälsoorganisationens samarbetscentrums förrådsarkiv, och även om de uppvisar låg sekvensdivergens är de representativa för den största geografiska och tidsmässiga mångfalden inom samlingen. Den cSNP-avledda fylogenin för dessa isolat ger en topologi som överensstämmer med historiska mänskliga migrationsmönster, befolkningsexpansion och dokumenterade smittkoppsepidemier. Den avbildade topologin stöder hypotesen (fig. 3) att två klasser av variola divergerade från ett urvirus och därefter utvecklades i geografiskt åtskilda människopopopulationer. Även om orsaken till att alastrim och VARV major har olika patogenes hos människor är oklar, ger den genetiska strukturen hos alastrim minor och dess topologi tillsammans med de andra VARV-isolaten viktiga bitar till det evolutionära pusslet kring smittkoppor. Denna föreslagna fylogeni för VARV förlänger den evolutionära tiden för smittkoppor i förhållande till tidigare teorier.