Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är en form av kolonnkromatografi där man pumpar en provblandning eller en analytisk substans i ett lösningsmedel (den mobila fasen) under högt tryck genom en kolonn med kromatografiskt fyllnadsmaterial (stationär fas). Provet transporteras av en rörlig bärgasström av helium eller kväve. HPLC har förmågan att separera och identifiera föreningar som finns i alla prov som kan lösas upp i en vätska i spårkoncentrationer så låga som delar per biljon. På grund av denna mångsidighet används HPLC i en mängd olika industriella och vetenskapliga tillämpningar, t.ex. inom läkemedels-, miljö-, kriminalteknik- och kemikaliebranschen.
Provets retentionstid varierar beroende på interaktionen mellan den stationära fasen, de molekyler som analyseras och det eller de lösningsmedel som används. När provet passerar genom kolonnen interagerar det mellan de två faserna med olika hastighet, främst på grund av olika polariteter i analyterna. Analyter som har minst interaktion med den stationära fasen eller mest interaktion med den rörliga fasen kommer att lämna kolonnen snabbare.
Instrumentering:
De viktigaste komponenterna i ett HPLC-system är lösningsmedelsbehållaren, eller flera behållare, en högtryckspump, en kolonn, ett injektorsystem och detektorn.
Detektionsgräns |
Gasrekommendation |
Regulatorrekommendation |
| Spillgas | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Helium 5.0 | BASELINE C106-serien |
Reservoaren innehåller lösningsmedlet, som kallas den rörliga fasen eftersom den rör sig. Det finns vanligtvis minst två reservoarer i ett system, där var och en rymmer upp till 1 000 cc lösningsmedel och vanligen är utrustad med en gasdiffusor genom vilken helium kan bubblas. En pump används för att generera ett specificerat flöde av den rörliga fasen. Även om det fortfarande är möjligt att injicera proverna manuellt är de flesta HPLC-system nu helt automatiserade och datorstyrda. Injektorn, eller den automatiska provtagaren, introducerar lösningsmedlet i ett fasflöde som för provet in i högtryckskolonnen (upp till 400 bar), som innehåller det specifika packningsmaterial som behövs för att åstadkomma separationen. Packningsmaterialet kallas den stationära fasen eftersom det hålls på plats av kolonnens hårdvara.
En detektor behövs för att se de separerade föreningsbanden när de elueras från högtryckskolonnen. Informationen skickas från detektorn till en dator som genererar kromatogrammet. Den rörliga fasen lämnar detektorn och skickas antingen till ett avfall eller samlas upp, beroende på vad som önskas.
Heliumsparing är en effektiv metod för att avgasa den rörliga fasen för att undvika instabila baslinjer som orsakas av löst luft. Kväve används som nebuliseringsgas i ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) där lösningsmedlet avdunstar från provet och lämnar en dimma som mäts.
Högpresterande vätskekromatografi – andra HPLC-typer
Ultra högpresterande vätskekromatografi (uHPLC):
Vid standard-HPLC används vanligtvis kolonnpartiklar med en storlek på 3 till 5 µm och ett tryck på cirka 400 bar, medan man vid uHPLC använder specialdesignade kolonner med partiklar med en storlek på ned till 1,7 µm vid ett tryck på mer än 1000 bar. Den största fördelen med uHPLC är hastigheten. Dessa system är snabbare, känsligare och förlitar sig på mindre volymer av organiska lösningsmedel än standard-HPLC, vilket gör att man kan köra fler prover på kortare tid. Om systemen körs vid typiska tryck över 800 bar åldras eller försämras kolonnerna snabbare. Nyare teknik håller på att utvecklas för uHPLC-enheter för att använda kolonnpartiklar med en storlek på 1 µm och tryckpotentialer på upp till 6 800 bar.
uHPLC är också känt som UPLCTM, ett varumärke som tillhör Waters Corporation.
Snabb proteinvätskekromatografi (FPLC):
FPLC är ett system som liknar högpresterande vätskekromatografi och som används för att separera eller rena proteiner och andra biomolekyler från komplexa blandningar. Den största skillnaden mellan FPLC och HPLC är standardarbetstrycket. FPLC-kolonner kan endast användas upp till ett maximalt tryck på 3-5 MPa. Om trycket i HPLC kan begränsas kan nästan alla FPLC-kolonner också användas i ett HPLC-system.