Dos- och tidseffekter av koffeinintag på mänskliga trombocytens Adenosin A2A-receptorer

Koffein, som finns i olika källor som kaffe, te, choklad och coladrycker, är den mest spridda aktiva substansen i världen. Den genomsnittliga koffeinförbrukningen hos vuxna människor varierar mellan olika kulturer och nationer från 80 till 400 mg per person och dag.1 Koffein framkallar ett varierat antal farmakologiska reaktioner, bland annat ökad vaksamhet, minskad psykomotorisk reaktionstid och ökad sömnlatens och vakenhetstid, och kan även påverka den intellektuella prestationen.2 Dessutom orsakar koffein avslappning av glatta muskler, ökar utsöndringen av magsyra och frisättningen av katekolaminer samt ökar den metaboliska aktiviteten.3

Den exakta mekanismen eller mekanismerna som ligger till grund för koffeinets verkan är fortfarande dåligt definierad. Även om inhibering av fosfodiesteraser kan bidra till koffeinets verkan,4 finns det allt fler bevis för att de flesta farmakologiska effekterna av detta xantin beror på antagonism av adenosinreceptorer som betecknas som A1-, A2A-, A2B- och A3-subtyper.5 Koffein verkar mest potent på A2A-receptorer, tätt följt av A1-receptorer, därefter A2B-receptorer,6 och som en svag antagonist på mänskliga A3-receptorer. Blockering med koffein av adenosinreceptorer, nämligen A1- och A2A-receptortyperna, hämmar effekten av endogent adenosin på en rad olika fysiologiska processer.7 Under normala förhållanden tycks blodnivåer av adenosin vara tillräckliga för att toniskt aktivera A2A-receptorer i trombocyter. Nyligen rapporterades att trombocytaggregationen ökade hos möss med A2A-receptor-knockout, vilket tyder på att denna receptorsubtyp är viktig för trombocytfunktionen8 . Det är därför tänkbart att koffein skulle kunna blockera dessa toniskt aktiverade A2A-receptorer i trombocyter och förändra deras funktioner som moduleras av adenosin.

I många år har man misstänkt ett samband mellan kaffedrickande och kardiovaskulära sjukdomar, särskilt kranskärlssjukdomar,9 men på senare tid har det visats att kaffe- eller koffeinkonsumtion inte ökar risken för kranskärlssjukdomar eller stroke.1011 I ett stort antal epidemiologiska studier med hänsyn till hjärtinfarkt har man inte funnit någon skadlig effekt av <5 koppar kaffe per dag, medan resultaten är kontroversiella vid högre intagsnivåer.12 Hos patienter med högt blodtryck observerades ingen risk för negativa resultat oavsett nivå på koffeinintaget.13

En studie av Biaggioni et al14 fann att en upprepad dosering av koffein leder till betydande förändringar i mänskliga trombocyter i de funktionella svaren på adenosinreceptoragonisten 5′-N-etylkarboxamidoadenosin (NECA). Koffeinuttag gav upphov till en betydande vänsterförskjutning av den NECA-inducerade aggregeringshämningen.14 I överensstämmelse med detta visade vi nyligen,15 hos försökspersoner som behandlades med 750 mg/d i 1 vecka, att kroniskt intag av koffein förändrar trombocytaggregabiliteten till följd av uppreglering av A2A-receptorerna som finns på trombocytaggregatets yta.

I denna artikel ger vi ytterligare belägg för att ett liknande gensvar finns hos försökspersoner som behandlades med koffein i olika doser, t.ex. 600 mg/d i 1 vecka eller 400 mg/d, som administreras under en längre tidsperiod, t.ex. 2 veckor. I den aktuella studien gjordes detta genom att direkt mäta förändringar i adenosin A2A-receptorerna (densitet och affinitet) och deras funktion genom att bestämma effekten av den A2A-selektiva agonisten 2-hexynyl-NECA (HE-NECA) för att (1) öka cAMP-ackumulationen, (2) hämma trombocytaggregationen och (3) minska de intracellulära kalciumnivåerna. Efter kronisk konsumtion (600 mg/d i 1 vecka eller 400 mg/d i 2 veckor) fann man en uppreglering av trombocyternas adenosin A2A-receptorer, vilket var starkt korrelerat med antiaggregatoriska effekter, en ökning av cAMP-ackumulationen och en minskning av de intracellulära kalciumnivåerna. Inga skillnader påvisades på bindnings- och funktionsparametrar från försökspersoner som behandlades med 400 mg/d i 1 vecka.

Metoder

Fyrtiofem friska, icke-rökande försökspersoner, 25 till 45 år gamla, av båda könen, studerades. Efter att ha gett skriftligt informerat samtycke ombads försökspersonerna att avstå från metylxantiner i kosten i ≥2 veckor. De delades in i tre grupper (15 försökspersoner vardera) enligt koffeinadministrationsregimen (dvs. dos och administreringstid): 200 mg oralt 2 gånger dagligen under en period av 7 dagar (grupp 1), 200 mg oralt 2 gånger dagligen under en period av 14 dagar (grupp 2) och 200 mg oralt 3 gånger dagligen under en period av 7 dagar (grupp 3). Trombocyter från dessa försökspersoner undersöktes innan de började med koffein (dag 0) och 1, 12, 60 och 108 timmar efter den sista dosen koffein. Särskilt tidpunkten 1 timme undersöktes endast i den grupp som fick den högsta dosen koffein (600 mg/d). EC50 och IC50 i funktionella analyser kunde inte erhållas vid 1 timme på grund av de praktiska problem som är kopplade till överdriven blodprovstagning under en snäv tidsperiod (1 till 12 timmar).

SCH 58261 Bindningsanalys i mänskliga trombocytmembran

Membran från humana trombocyter framställdes enligt tidigare beskrivning16 och användes för radioligandbindningsanalyser med SCH 58261 i enlighet med Varani et al.17. I mättnadsstudier inkuberades mänskliga trombocytmembran med 8 till 10 olika koncentrationer av SCH 58261 som varierade från 0,01 till 10 nmol/L. Icke-specifik bindning bestämdes i närvaro av NECA 10 μmol/L. Efter 60 minuters inkubation vid 4 °C filtrerades proverna genom Whatman GF/B-filter med en Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co). Ett viktat icke-linjärt minsta kvadraters kurvanpassningsprogram, LIGAND,18 användes för datoranalys av data från mättnadsexperimenten.

Mätning av cAMP-nivåer i mänskliga trombocyter

Tvättade mänskliga trombocyter som erhållits från det perifera blodet från friska frivilliga personer preparerades enligt tidigare beskrivning.16 Trombocyter (6×104 till 8×104 celler) inkuberades med 1,0 U adenosindeaminas/mL, 0,5 mmol/L 4-(3-butoxy-4-metoxibenzyl)-2-imidazolidinon (Ro 20-1724) som fosfodiesterashämmare och 6 till 8 olika koncentrationer av HE-NECA. EC50-värdena erhölls från koncentrations-responskurvor efter log-logit-transformation av de beroende variablerna med hjälp av en viktad minsta kvadratmetoden.19 Den slutliga vattenlösningen testades med avseende på cAMP-nivåerna med hjälp av en kompetitiv proteinbindningsanalys.15

Platelet Aggregation Assay

Citrerat människoblod centrifugerades vid 200 g i 10 minuter för att erhålla trombocytrik plasma och vid 2500 g i 20 minuter för att erhålla trombocytfattig plasma. Antalet mänskliga trombocyter räknades i en Coulter Counter modell S8/80 (Coulter Electronics Inc) och justerades till 2,5×108/mL till 3,5×108/mL med autolog trombocytfattig plasma. Trombocytaggregation utfördes enligt Borns turbidimetriska teknik20 med en DIC PA-3220 Aggrecorder (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Efter inkubation i 3 minuter med 6 till 8 olika koncentrationer av HE-NECA aggregerades trombocytrik plasma vid 37 °C under kontinuerlig omrörning med ADP. Liknande experiment utfördes med ADP i olika koncentrationer (100 nmol/L till 100 μmol/L). Maximal aggregering, som registrerades 5 minuter efter tillsats av ADP, användes för den kvantitativa analysen, och procentandelen hämning beräknades i förhållande till kontrollvärden.21

Mätningar av koncentrationen av fritt Ca2+ i cytoplasma

Koncentrationen av fritt kalcium i cytosol mättes med hjälp av fura 2-tekniken i enlighet med Paul et al.22 Kortfattat: Trombocyter inkuberades i totalt mörker i 30 minuter vid 37 °C med 1 μmol/L fura 2-AM och omrördes magnetiskt i fluorimeterkuvetter (LS50, Perkin Elmer, Ltd) vid en koncentration på 108/mL i närvaro av 250 μmol/L sulfinpyrazon. Den intracellulära Ca2+-koncentrationen (i) bestämdes vid ett excitationsförhållande på 340/380 och en emissionsvåglängd på 505 nm.

Statistisk analys

Analysen av data utfördes med 1-vägs ANOVA. Analys av skillnaden mellan koffeinbehandlade grupper (12, 60 och 108 timmar) och kontrollpersoner gjordes med Students t-test (oparad analys). Skillnader ansågs vara signifikanta vid ett värde på P<0,01. Alla data rapporteras som medelvärde±SEM.

Resultat

Plättar från de tre grupperna av försökspersoner skördades innan administreringen av koffein påbörjades (dag 0, kontroll) och vid 1, 12, 60 och 108 timmar efter den sista dosen (koffeinavvänjning). I tabellen sammanfattas resultaten av bindnings- och funktionella experiment från de 3 grupperna av försökspersoner.

Grupp 1 (400 mg/d i 1 vecka)

Bindningsparametrar avslöjade ett kontroll Bmax-värde på 105±6 fmol/mg protein och ett KD-värde på 1,28±0,08 nmol/L. I kontrolltrombocyter ökade HE-NECA cAMP-nivåerna med en EC50 på 60±5 nmol/L och hämmade (1) aggregering med en IC50 på 86±10 nmol/L och (2) kalciumnivåer med en IC50 på 104±8 nmol/L. Inga statistiskt signifikanta skillnader hittades i bindnings- och funktionsparametrar vid 12, 60 och 108 timmar efter koffeinavvänjning (tabell).

Grupp 2 (400 mg/d i 2 veckor)

Bindningsparametrar avslöjade ett kontroll Bmax-värde på 110±3 fmol/mg protein och ett KD-värde på 1,21±0,09 nmol/L. Vid 12 och 60 timmar efter koffeinavvänjning ökade receptortätheterna, Bmax, vid båda tidpunkterna med cirka 20 %, men KD-värdena var oförändrade. Funktionella experiment visade att adenosin A2A-receptoragonisten HE-NECA var betydligt mer potent när det gällde att öka trombocytens cAMP (dvs. EC50-värdena var 45 % och 65 % mindre vid 12 respektive 60 timmar efter koffeinavvänjning än kontrollvärdena). En liknande trend observerades i de IC50-värden som erhölls i aggregeringsexperiment och i mätningar av koncentrationen av cytoplasmatiskt fritt kalcium (tabell).

Grupp 3 (600 mg/d i 1 vecka)

Sammantaget erhölls data som liknade dem i grupp 2. SCH 58261 bands till en enda affinitetsklass av platser i trombocytmembran från kontroller med en Bmax på 100±4 fmol/mg protein och en KD på 1,27±0,09 nmol/L. Som visas i figur 1A, i membran från trombocyter som skördats 1, 12, 60 och 108 timmar efter koffeinuttag, band radioliganden med samma affinitet, men antalet bindningsställen (Bmax) ökade signifikant (P<0,01). I parallella studier bestämdes trombocyternas funktionella svar på A2A-receptoragonisten HE-NECA. Som sammanfattas i tabellen ökade HE-NECA:s styrka att (1) öka cAMP-bildningen, (2) hämma ADP-inducerad trombocytaggregation och (3) sänka kalciumnivåerna signifikant i trombocyter som erhållits 12, 60 och 108 timmar efter koffeinavvänjning (figur 1B, 1C och 1D). Experiment utfördes också för att avgöra om ökningen av tätheten av A2A-receptorer skulle åtföljas av en minskning av ADP:s potens och/eller effektivitet för att inducera aggregering. EC50-värdena för ADP för att stimulera trombocytaggregation vid 12, 60 och 108 timmar efter koffeinavvänjning var 0,7±0,2, 0,9±0,1 respektive 0,8±0,1 μmol/L, värden som inte skiljer sig signifikant från 0,9±0,1 μmol/L.2 μmol/L som erhölls i trombocyter från kontroller (figur 2).

Diskussion

Effekterna av långvarig administrering av koffein hos människor och djur och dess roll för deras tolerans mot koffeinets verkan är kontroversiella. Vissa studier som visade en ökning av A1-receptorer i mushjärnan fann bevis för en dosberoende uppreglering av A1-receptorer av koffein.23 Andra studier visade en uppreglering av A2A-receptorer, vilket tyder på en adaptiv effekt av koffeinintag.24 Dessutom kan kronisk koffeinkonsumtion leda till minskad trombocytaggregation till följd av uppreglering av A2A-receptorerna som finns på trombocytaggregatets yta14 och som spelar en potentiell roll i patofysiologiska processer, t.ex. aggregering och trombocythet. Även om sådana förändringar kan bidra till förändringar i trombocytfunktionen ändrar tolerans mot koffein inte styrkan hos detta xantin som en konkurrenskraftig antagonist av adenosineffekterna.25 Andra förändringar, t.ex. förskjutning av receptoraffinitet till ett tillstånd med hög affinitet, förändringar i G-proteinnivåerna eller kopplingen mellan dessa proteiner och adenosinreceptorerna, eller långvarig receptorbeläggning, kan vara inblandade i toleransfenomenet.26 Koffein ger hos människor abstinenssymtom som vanligtvis består av huvudvärk, trötthet, apati och sömnighet.9 Koffein ökar framför allt plasmakoncentrationen av adenosin, och minskningen av denna koncentration efter antagonistuttag tyder på en receptormedierad reglering av plasmakoncentrationen av adenosin.27 Under ischemi och/eller hypoxi har adenosin också neuroprotektiva effekter. I den vuxna hjärnan minskar kronisk koffeinbehandling, som leder till uppreglering av adenosinreceptorer, ischemisk skada, medan akut exponering (receptorantagonistisk effekt) ökar ischemisk skada.28

Det har visats att kroniskt intag av koffein förändrar trombocyternas svar på adenosinets verkan.14 Upprepad administrering av koffein (750 mg/d i en vecka) visade en ökning av A2A-receptortätheten, åtföljd av sensibilisering av trombocyternas reaktioner, t.ex. en ökning av cAMP-ackumulationen och en minskning av trombocytaggregationen.15 Syftet med den aktuella studien var att fastställa effekten av koffein-dosering och administreringstidens längd på bindnings- och funktionsparametrar. Därför studerade vi förändringarna i täthet och affinitet hos adenosin A2A-receptorer i mänskliga trombocytmembran hos försökspersoner som behandlades med olika doser (400 eller 600 mg/d) under olika perioder av koffeinintag (1 eller 2 veckor). Specifikt studerade vi kontrollpersoner (före koffeinadministration) och koffeinbehandlade (1, 12, 60 och 108 timmar efter den sista dosen koffein)

Behandlingen med 400 mg/d koffein i 1 vecka ändrade inte A2A-receptorernas bindnings- och funktionsparametrar. Behandling med 400 mg/d i 2 veckor eller 600 mg/d i 1 vecka resulterade dock i (1) en signifikant ökning (uppreglering) av adenosin A2A-bindningsställen, (2) en ökning av cAMP-ackumulationen, (3) en ökning av antiaggregatoriska effekter och (4) en minskning av kalciumnivåerna framkallade av A2A-receptoragonisten HE-NECA.

Uppregleringen av A2A-receptorer kan troligen tillskrivas syntesen av nya receptorer under differentiering av prekursorceller. Denna tolkning bygger på resultaten av in vitro-experiment som visar att inkubation av trombocytrik plasma från kontrollpersoner under 6 eller 12 timmar med koffein eller SCH 58261 inte påverkade bindningsparametrarna.15 Uppregleringen av adenosin-A2A-receptorer som orsakas av kroniskt intag av koffein kan tolkas som att endogent adenosin har ett toniskt inflytande på mänskliga trombocyter, och närvaron av antagonisten motverkas av uppregleringen av A2A-receptorer. Hos vuxna adsorberas koffein effektivt från mag-tarmkanalen; de högsta plasmakoncentrationerna inträffar 15 till 120 minuter efter intag och halveringstiden för koffein är 2,5 till 4,5 timmar7 . Ökningen av adenosin A2A-receptorer som hittades 1 timme efter den sista dosen koffeinbehandling liknade den som erhölls 12 eller 60 timmar efter koffeinavvänjning, vilket visar att avvänjningen inte var nödvändig för uppregleringen av A2A-receptorer.

Ett annat syfte med den aktuella studien var att fastställa om förändringarna i bindningsparametrar korrelerade med förändringar i funktionella respons(er). Man fann att trombocytaggregation var förknippad med aktivering av adenylatcyklas och med en ökning av intracellulära kalciumkoncentrationer. Styrkan hos HE-NECA 12, 60 och 108 timmar efter koffeinavvänjning var signifikant ökad jämfört med kontrollgruppen. Detta resultat tyder på att upprepad administrering av olika doser koffein leder till betydande förändringar i antalet A2A-receptorer på trombocytans yta, tillsammans med en ökad responsivitet för receptorstimulering. Den klassiska adenosin A2A-receptorn är ansvarig för de antiaggregatoriska egenskaperna hos adenosin och dess analoger, vilket stämmer överens med observationen att aggregeringen är effektivare hos möss som saknar A2A-receptorerna.8 Den trombocytaggregation som inducerades av ökande koncentrationer av ADP skiljde sig dock inte signifikant mellan kontroll- och koffeinbehandlade försökspersoner. En möjlig förklaring till denna senare observation är att det inte finns tillräckligt med adenosin i testmediet för att framkalla en reaktion. Alternativt var storleken på receptoruppregleringen (dvs. antalet receptorer) hos de koffeinbehandlade försökspersonerna inte tillräcklig för att åstadkomma en förskjutning av den ADP-inducerade aggregeringskoncentrationsresponskurvan. När nivåerna av endogent adenosin ökar, t.ex. under ischemi i hjärtmuskeln, stiger den extracellulära koncentrationen av adenosin snabbt till en nivå som är tillräcklig för att verka på uppreglerade receptorer och kan ha större trombocythämmande effekter än kontroll. Det är således möjligt att kronisk koffeinintag i doser som inte ligger långt ifrån det genomsnittliga kostintaget kan leda till en paradoxal minskning av trombocytaggregabiliteten under ischemi.

Sammanfattningsvis ger alla data tillsammans ytterligare bevis för att kroniskt intag av koffein förändrar trombocyternas svar på adenosinets verkan. Det viktigaste resultatet av denna studie är att effekterna av kronisk koffeinintag på trombocytfunktionen är beroende av både dosen och behandlingens varaktighet och ligger till grund för en minskning av trombocytaggregabiliteten på grund av uppreglering av adenosin A2A-receptorerna.

Fotnoter