Celler i det vuxna mänskliga hjärtat

Datarapportering

Ingen statistisk metod användes för att förutbestämma urvalsstorleken. Experimenten var inte randomiserade och utredarna var inte blinda för allokering under experiment och resultatbedömning.

Forskningsetik för donatorvävnader

Hjärtavävnader (donatorer D1-D7 och D11) bearbetades vid Wellcome Sanger Institute (Hinxton, Storbritannien) och erhölls från avlidna transplanterade organdonatorer efter godkännande av forskningsetiska kommittéer (ref 15/EE/0152, East of England Cambridge South Research Ethics Committee) och informerat samtycke från donatorfamiljerna. Hjärtvävnader (donatorer H2-H7) bearbetades vid Harvard Medical School (Boston, Massachusetts, USA) och erhölls från avlidna organdonatorer efter godkännande av Human Research Ethics Board Pro00011739 (University of Alberta, Edmonton, Kanada). Informerat samtycke från donatorfamiljerna inhämtades via institutionens Human Organ Procurement and Exchange Program (HOPE). Den kardiovaskulära anamnesen var okej för alla donatorer (kompletterande tabell 1).

Vävnadsförvärv och bearbetning

Vävnader förvärvades från brittiska och nordamerikanska donatorer (D1-7 och 11, H2-7) efter cirkulationsdöd (DCD) (D2, D4-D7 och D11) och efter hjärndöd (DBD) (D1, D3, H2-H7). För brittiska DCD-donatorer öppnas bröstkorgen efter fem minuters väntan och för DBD öppnas bröstkorgen, aortan korsförklamras och hjärtprover tas. För nordamerikanska DBD-donatorer korsförsluts aortan, kall kardioplegi (Celsior) administreras under tryck via aortan för att stoppa slaget, hjärtat avlägsnas, sköljs i kall saltlösning och prover tas. Alla donatorprover var myokardbiopsier i full tjocklek från vänster och höger förmak, vänster och höger kammare, interventrikulär septum och apex, med avsiktlig uteslutning av stora epikardiella fettdepåer. Prover som användes för isolering av enskilda kärnor snabbfrystes och förvarades vid -80 °C. Isolering av enskilda celler och CD45+-anrikning utfördes på nyinsamlade prover. Resterande vävnad efter kärn- och cellisoleringsförfaranden formalinfixerades eller frystes i OCT för ytterligare studier.

Alla vävnader förvarades och transporterades alltid på is fram till frysning eller vävnadsdispensering för att minimera eventuell transkriptionsnedbrytning. Tidigare studier av GTEx-konsortiets vävnadsstabilitet efter döden på bulkvävnader68 och i enskilda celler69 tyder på att vävnaderna endast genomgår mindre förändringar inom de första 24 timmarna efter döden när de förvaras under kalla förhållanden.

Isolering av enskilda kärnor

Enskilda kärnor erhölls från blixtfrysta vävnader med hjälp av mekanisk homogenisering enligt tidigare beskrivning70. Vävnader homogeniserades med hjälp av en 7 ml Dounce-vävnadskvarnsats i glas (Merck) med 8-10 slag med en lös pistill (A) och 8-10 slag med en fast pistill (B) i homogeniseringsbuffert (250 mM sackaros, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1× proteashämmare, 0.4 U μl-1 RNaseIn, 0,2 U μl-1 SUPERaseIn, 0,1 % Triton X-100 i nukleasfritt vatten). Homogenatet filtrerades genom en 40-μm cellsilter (Corning). Efter centrifugering (500 g, 5 min, 4 °C) avlägsnades supernatanten och pelleten resuspenderades i lagringsbuffert (1× PBS, 4 % bovint serumalbumin (BSA), 0,2 U μl-1 Protector RNaseIn). Kärnorna färgades med NucBlue Live ReadyProbes-reagens (ThermoFisher) och Hoechst-positiva enskilda kärnor renades genom fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS) med hjälp av influx, XDP eller FACSAria (BD Biosciences) (kompletterande figur 1). Kärnornas rening och integritet kontrollerades i mikroskop, och kärnorna bearbetades vidare med hjälp av Chromium Controller (10X Genomics) enligt tillverkarens protokoll.

Preparering av enskilda celler

Hjärttrådar (0.2-0,9 g) överfördes från kardioplegisk lösning till GentleMACS C-rör (Miltenyi Biotec) som innehöll enzymatisk digestionsbaslösning (100 μg ml-1 liberas TH Research grade och 50 μg ml-1 DNas I, HBSS 10 mM HEPES och 30 mM taurin)71 . Vävnaderna hackades med en sax (FST) och smältes automatiskt med hjälp av gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) med värmare. Kardiomyocytutarmade encellssuspensioner tvättades med baslösning innehållande 20 % fetalt bovint serum (FBS) (Gibco), filtrerades genom 70-μm nylonfilter (BD Falcon), samlades upp genom centrifugering (330 g, 10 minuter, 4 °C) och resuspenderades i baslösning innehållande 0,2 % FBS (Gibco). Cellerna räknades manuellt tre gånger genom uteslutning av Trypanblått efter varje centrifugering och resuspensionerades till en koncentration på minst 2 × 106 ml-1. Enskilda celler bearbetades med Chromium Controller (10X Genomics) enligt tillverkarens protokoll.

CD45+ cellberikning

Cellsuspensionen framställdes enligt beskrivningen ovan och märktes därefter med hjälp av anti-humana CD45 monoklonala antikroppskonjugerade mikrokulor enligt tillverkarens protokoll (Miltenyi Biotec). Upp till 107 celler inkuberades i 15 minuter vid 4 °C i 80 μl PBS-, BSA- och EDTA-buffert (1× PBS pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) med 20 μl CD45-mikrokulor. Cellsuspensionen tvättades i PBS, BSA, EDTA-buffert en gång och samlades upp genom centrifugering (330 g, 10 minuter, 4 °C). De resuspenderade cellerna applicerades på MACS LS-kolonner (Miltenyi Biotec). Den CD45-depleterade cellfraktionen kasserades efter tre tvättar med PBS, BSA och EDTA-buffert och CD45+-cellfraktionen samlades upp i PBS, BSA och EDTA-buffert genom att kolonnerna avlägsnades från magnetfältet. CD45+-celler räknades och resuspenderades i PBS, BSA och EDTA-buffert till en koncentration på minst 2 × 106 per ml före vidare bearbetning med hjälp av en Chromium Controller (10X Genomics) enligt tillverkarens protokoll.

Krom 10X-biblioteksberedning

Enskilda celler och kärnor räknades manuellt med hjälp av trypanblåsexkludering eller automatiskt med hjälp av en Countess II (Life Technologies) med minst två separata räkningar. Cell- eller kärnsuspensionen justerades till 400-1 000 celler per mikroliter och laddades på Chromium Controller (10X Genomics) med en målinriktad cell- eller kärnåtervinning på 4 000-10 000 per reaktion. 3′ genuttrycksbibliotek framställdes enligt tillverkarens anvisningar för v2 eller v3 Chromium Single Cell Reagent Kits (10X Genomics). Kvalitetskontrollen av cDNA och slutliga bibliotek gjordes med hjälp av Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent) eller 4200 TapeStation System (Agilent). Biblioteken sekvenserades med HiSeq 4000 (Illumina) vid Wellcome Sanger Institute och NextSeq 500 (Illumina) vid Harvard Medical School med ett minsta djup på 20 000-30 000 läspar per cell eller kärna (kompletterande tabell 22).

Spatial validering med hjälp av smFISH med RNAscope-prober

Vid framställningen av formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) prover fixerades färsk vävnad i neutralt buffrat 10 % formalin i 18-36 timmar och bäddades därefter in i paraffinblock. Fastfrysta vävnadsprover fixerades i 4 % paraformaldehyd (ThermoFisher). Sektioner klipptes med 5 μm tjocklek med hjälp av en mikrotom och placerades på SuperFrost Plus-objektsglas (VWR). FFPE-vävnadsglasen färgades automatiskt med BOND RX (Leica) och RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Assay (ACDBio) enligt tillverkarens protokoll. Fastfrysta vävnadsglas behandlades enligt protokollet för RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v1 (ACDBio). RNAscope färdiga eller skräddarsydda målprober kördes parallellt med multiplex positiva och negativa kontroller (Extended Data Fig. 12b, Supplementary Table 23). Alla kärnor var DAPI-färgade. Alla FFPE-vävnadsglas avbildades med hjälp av ett Opera Phenix High-Content konfokalt screeningsystem (Perkin Elmer) med en z-stegsstorlek på 1 μm och ett 20× vattenimmersionsobjektiv (NA 0,16, 0,299 μm per pixel). Kanaler: DAPI (excitation 375 nm, emission 435-480 nm), Atto 425 (excitation 425 nm, emission 463-501 nm), opal 520 (excitation 488 nm, emission 500-550 nm), opal 570 (excitation 561 nm, emission 570-630 nm), opal 650 (excitation 640 nm, emission 650-760 nm). Fixerade frysta vävnadsglas avbildades med hjälp av ett konfokalmikroskop LSM710 (Zeiss) och 40× oljedimringsobjektiv (1,3 olja, DIC III). Kanaler: DAPI (excitation 375 nm, emission 435-480 nm), Alexa Fluor 488 (excitation 492 nm, emission 517 nm), Atto 550 (excitation 560 nm, emission 575 nm) och Atto 647 (excitation 649 nm, emission 662 nm). Visualisering och bakgrundsborttagning (rolling ball radius) gjordes med hjälp av Fiji/ImageJ72. Pseudofärger användes för bättre visualisering.

Haematoxylin- och eosinfärgning

Vävnadsproverna frystes friskt i isopentan (ThermoFisher) vid -80 °C och bäddades in i OCT (VWR). Sektioner skars med en tjocklek på 10 μm med hjälp av en mikrotom, placerades på SuperFrostPlus-objektsglas (VWR) och bearbetades vidare enligt ett standardprotokoll för hematoxylin- och eosinfärgning (Extended Data Fig. 12a).

Förvärv av skelettmuskelvävnad

Prover från musklerna i mellankostalregionen togs från mellan det andra och tredje revbenet på vänster sida. Detta är vanligtvis från det djupaste muskelskiktet (längst bort från huden). Proverna samlades in direkt i den kalla konserveringslösningen.

Kärnisolering av skelettmuskulatur

Muskelvävnad tvättades i 1× PBS, rengjordes från synliga fettavlagringar och hackades för att få fragment på cirka 1 mm3. Per prov homogeniserades cirka 0,3 g hackad vävnad i 3 ml buffert A (250 mM sackaros, 10 mg ml-1 BSA, 5 mM MgCl2, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasIn, 1× proteashämmare) med hjälp av Dounce vävnadskvarnssats (Merck) med 50 slag med den lösa stötpinnen (A). Homogenatet filtrerades genom en 100-μm cellfilter (Corning) och filtret tvättades med 1 ml och sedan 750 μl buffert A. Efter tillsats av Triton X-100 (slutkoncentration 0,5 %) homogeniserades blandningen ytterligare med 50 slag med den fasta pesteln (B). Efter filtrering genom en 40-μm sil centrifugerades kärnorna (3 000 g, 5 minuter, 4 °C), resuspenderades i 1 ml buffert B (320 mM sackaros, 10 mg ml-1 BSA, 3 mM CaCl2, 2 mM magnesiumacetat, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1× proteashämmare, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasin) och renades med hjälp av en 27 % Percollgradientlösning. Percollblandningen centrifugerades vid 20 000 g (15 min, 4 °C) och pelletsen resuspenderades i 200 μl buffert B, följt av centrifugering (20 000 g, 3 min, 4 °C). Efter färgning med Trypanblått räknades de intakta kärnorna med en hemocytometer. Kärnorna profilerades med hjälp av en Chromium Controller (10X Genomics) enligt tillverkarens protokoll.

Encellsisolering för skelettmuskulatur

Muskelvävnad tvättades i 1× PBS, rengjordes från synliga fettavlagringar och hackades fint. Därefter överfördes 2 g av den hackade vävnaden till digestionsbuffert 1 (750 U ml-1 kollagenas typ 2 i 1× PBS) och inkuberades vid 37 °C i ett vattenbad i 90 minuter. Den delvis smälta vävnaden samlades upp genom centrifugering (650 g, 5 minuter, 4 °C) och pelletsen återuppsattes i digestionsbuffert 2 (100 U ml-1 kollagenas typ 2, 2 U ml-1 dispas i PBS). Efter 30 minuters inkubation vid 37 °C i ett vattenbad stoppades digestionen genom tillsats av 2 % FBS. Cellerna filtrerades genom en 100-μm- och en 40-μm-nylonsil (BD Falcon), samlades upp genom centrifugering (650 g, 4 °C, 3 minuter) och tvättades med 1× PBS, 2 % FBS. Därefter användes en 20 % Percollgradient (15 000 g, 4 °C, 20 minuter) för cellrening. Skiktet som innehöll celler samlades upp, tvättades i PBS innehållande 2 % FBS och livskraftiga celler räknades genom uteslutning av Trypanblått med hjälp av en hemocytometer. Kärnorna profilerades med hjälp av en Chromium Controller (10X Genomics) enligt tillverkarens protokoll.

Tabellen över nyckelresurser för metoder finns i kompletterande tabell 24.

Transkriptomkartläggning

Efter sekvensering demultiplexerades proverna och sparades som CRAM-filer. Varje prov kartlades till det mänskliga referensgenomet (GRCh38 v.3.0.0.0) som tillhandahölls av 10X Genomics och med hjälp av CellRanger-sviten (v.3.0.1) med standardparametrar. Prover från enskilda celler kartlades mot referensen så som den tillhandahölls. Single-nuclei samples, referensen för pre-mRNA, skapades med hjälp av 10X Genomics instruktioner (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references).

Bearbetning av räkneuppgifter

Efter kartläggningen grupperades proverna från varje datakälla (single-nuclei, single-cell och CD45+-cell) till enskilda AnnData-objekt genom att sammanfoga raw_feature_bc_matrix_h5.h5.h5 och lägga till lämplig metadatainformation. För varje datakällsobjekt beräknades medelvärdet av unika molekylära identifierare (UMI) (n_counts) och användes som tröskelvärde för tomma droppar.

Detektering av dubbletter

Efter avlägsnande av tomma droppar tillämpade vi scrublet73 för att tilldela en dubblettpoäng (scrublet_score) till varje cell. Dessa celler klustrades och visualiserades med hjälp av UMAP-metoden74. Dessutom bearbetades varje cell för att upptäcka dubbletter med hjälp av en perkolationsmetod för att möjliggöra förbättrad upptäckt av dubbletter75.

Cellkvalitetskontroll och filtrering

Varje datakälla bearbetades och annoterades separat för att ta hänsyn till källspecifika kvalitetsskillnader. Dessa mätvärden ingår som kovariater för vidare bearbetning. Totala celler och CD45+-celler filtrerades för antal (500 < n_counts <15 000), gener (200 < n_genes), mitokondriella gener (percent_mito <20%), ribosomala gener (percent_ribo <20%) och scrublet score (scrublet_score <0,3). Enstaka kärnor filtrerades för antal (500 < n_counts <15 000), gener (300 < n_genes <6 000), mitokondriella gener (percent_mito <5%), ribosomala gener (percent_ribo <5%) och scrublet score (scrublet_score <0,3). Samma filtreringströsklar tillämpades på datasetet för skelettmuskulatur.

Scanpy toolkit 1.576 in Python v.3.7 användes för att utföra nedströmsanalyser, inklusive normalisering (normalize_per_cell: counts_per_cell_after = 10 000), logtransformation (log1p), detektering av variabla gener (highly_variable_genes), regression av oönskade variationskällor (regress_out: n_counts och percent_mito), skalning av datafunktioner (scale: max_value = 10) och PCA (pca: using highly variable genes) enligt tidigare beskrivning77.

Batch alignment using deep variational autoencoder

Vi byggde en global manifold genom att anpassa alla datakällor och donatorer i våra data. Detta gjordes i ett förfarande i tre steg: (1) Varje källa analyserades och annoterades separat, med anpassning endast för donatorer med hjälp av ett linjärt regressionssteg för pericyte-space före batch-anpassning med bbknn78. Differentiellt uttryckta gener (DEG) beräknades med hjälp av ett Wilcoxon rangsummetest med Bonferroni-Hochberg-justering som implementerats i Scanpy-ramen. (2) För att annotera varje kluster använde vi ett integrativt tillvägagångssätt genom att söka efter de mest signifikanta DEG:erna (P < 1 × 10-5) med en logFC >1 mot databaserna ToppFun79 och EnrichR80. Signifikanta träffar på vägar, transkriptionsreglering och biologiska processer prioriterades för att annotera ett visst kluster. Varje cellutrymme märktes under adata.obs-platsen efter gruppering av källspecifika celltillstånd. (3) Alla källor kombinerades till ett enda AnnData-objekt under etiketten adata.obs. Partierna anpassades med hjälp av funktionen batch_correction från scGen variational autoencoder81. Först anpassar vi för adata.obs, med adata.obs som ankare. Därefter anpassar vi för adata.obs med adata.obs som ankare. Varje batchjusteringsrunda kördes i 50 epoker.

Manifolds för adipocyter, vaskulära och immuna hjärtpopulationer samt analysen av skelettmuskulatur skapades med denna metod och klusternoggrannheten utvärderades med SCCAF82 (Extended Data Fig. 12d).

DEGs

För att underlätta annoteringen av subpopulationerna i varje cellkompartment beräknade vi DEGs med hjälp av Wilcoxon rangsummetestet som implementerats i scanpy-arbetsflödet och som rekommenderas i nyligen genomförda benchmarkingstudier83. En gen ansågs vara differentiellt uttryckt om den har en log2-transformerad fold change > 1 och ett P < 1 × 10-5, om inte annat anges i analysavsnittet.

Cell-cellinteraktioner

Expressionsmatriserna för de populationer som undersöktes exporterades från AnnData, tillsammans med en metadatatabell som innehöll cell-barcodes som index. Vi körde sedan CellPhoneDB enligt följande: cellphonedb method statistical_analysis meta.tsv counts.tsv-counts-data = gene_name-threads = 60. CellPhoneDB:s råprediktioner filtrerades genom att ta bort de interaktioner med P > 1,0 × 10-5. Signifikanta par skickades sedan in för analys av anrikning av genuppsättningar i ReactomeDB, enrichR och ToppFun för funktionell klassificering. De vaskulära cellerna delades slumpmässigt ut till 39 000 celler före analysen, och gruppen för hjärtreparation (atriella och ventrikulära kardiomyocyter, FBs och immunceller) delades slumpmässigt ut till 69 295 celler före analysen.

Visualisering av genuttryck på 10X Genomics Visium-data

Vi bearbetade de allmänt tillgängliga Visium-data från 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.0.0/V1_Human_Heart) om vänster ventrikelmyokardiet med hjälp av Scanpy v.1..5 arbetsflöde anpassat för analys av 10X Genomics Visium-data (https://scanpy-tutorials.readthedocs.io/en/latest/spatial/basic-analysis.html). I korthet avlägsnades fläckar med mindre än 500 UMI eller mer än 20 000 UMI och mindre än 200 gener. Data log-transformerades och normaliserades före plottning.

Skattning av RNA-hastighet

För att beräkna RNA-hastigheten hos de enskilda cellerna och CD45+-berikade enskilda cellerna använde vi CellRanger-utgångens BAM-fil och GENCODE v33 GTF (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz)-filen tillsammans med velocyto84 CLI v.0.17.17 för att generera en loom-fil som innehåller kvantifieringen av spliced och unspliced RNA. Därefter byggde vi en manifold, klustrade cellerna och visualiserade RNA-hastigheterna med hjälp av scVelo85.

Subpopulationsanalyser av atriella och ventrikulära kardiomyocyter, FBs och neuronala celler

Alla streckkoder som i det globala objektet är märkta som kardiomyocyter, fibroblaster och neuronala celler valdes ut för ytterligare subpopulationsanalyser. Ytterligare cellpopulationsspecifika filterkriterier tillämpades på kärnor enligt följande: antal kardiomyocyter (n_counts <12 500), gener (n_genes <4 000), mitokondriella gener (percent_mito <1%), ribosomala gener (percent_ribo <1%) och scrublet score (scrublet_score <0.25); FB mitokondriella gener (percent_mito <1%), ribosomala gener (percent_ribo <1%); gener för neuronala celler (n_genes <4000), mitokondriella gener (percent_mito <1%), ribosomala gener (percent_ribo <1%). Totala celler och CD45+-celler exkluderades i datamängderna för atriella och ventrikulära kardiomyocyter och bidrog inte till subpopulationsanalysen. Ingen ytterligare filtrering av FBs eller neuronala celler totalt och CD45+-celler tillämpades. Kardiomyocyter och FBs delades sedan ytterligare upp i två grupperingar baserade på ursprungsregionen: (1) vänster och höger förmak och (2) vänster och höger ventrikel, apex och interventrikulär septum.

Donoreffekter anpassades enligt beskrivningen i steg (1) ovan. För FB och neuronala celler anpassades källorna enligt beskrivningen i steg (3) ovan. Leiden-klustring och UMAP-visualisering utfördes för att identifiera subpopulationer och visualisering86. Differentiellt uttryckta gener beräknades med hjälp av Wilcoxon rangsummetestet. Generna rangordnades efter poäng.

Tvärvävnadsjämförelse av immunpopulationer från hjärtat med immunpopulationer från skelettmuskulatur, njurar och blod

Vi samlade in encelliga transkriptomdata för vuxna njurar från ref. 99 (https://www.kidneycellatlas.org/), och delade upp alla immunceller som rapporterades i deras studie. För SKM valde vi ut de annoterade immuncellerna från det sammanslagna manifestet. För människoblodet använde vi det allmänt tillgängliga datasetet med 10 000 enskilda PBMC-celler som tillhandahålls av 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/3.0.0/pbmc_10k_v3). Som tidigare beskrivits87 tränade vi en logistisk regressionsmodell på hjärtats immunceller med hjälp av 80 % av expressionsdata och testade dess noggrannhet på de återstående 20 % för att få fram en modell med en noggrannhet på 0,6862 (Extended Data Fig. 8f, Supplementary Table 16). Vi tillämpade sedan denna modell för att förutsäga analoga kardiella immunpopulationer i den vuxna njuren, SKM och PBMCs. Förutsägelser med en sannolikhet mindre än 0,8 uteslöts från nedströms jämförande analyser.

Gene Ontology enrichment analysis

För den ventrikulära kardiomyocytpopulationen använde vi R-paketet gProfileR (https://cran.r-project.org/web/packages/gProfileR/index.html) med den poängsatta genlistan för vCM4 som ingångsvärde och uppsättningen gener som uttrycks i ventrikulära kardiomyocyter som bakgrund (de gener som har ett UMI-antal >1). För att utföra Gene Ontology-analysen av kärlcellerna söktes de 500 viktigaste signifikanta DEG:erna (P < 1 × 10-5) med en logtransformerad vikförändring > 1 mot Gene Ontology-databasen för biologiska processer med hjälp av ToppFun79 (kompletterande tabell 25). De fem mest signifikant berikade termerna (q < 0,05) för varje subpopulation valdes ut och plottades på en värmekarta. För att utföra väganalysen av adipocyterna söktes de 500 viktigaste signifikanta DEG:erna (P < 1 × 10-5) med en logtransformerad vikförändring > 0,5 mot ToppFun79:s vägdatabaser (kompletterande tabell 26). De fem mest signifikant berikade banorna (q < 0,05) för varje subpopulation valdes ut och plottades på en värmekarta.

Gen set score

Vi använder funktionen score_genes som är implementerad i scanpy för att beräkna berikningen av gener som är involverade i Oncostatin M-banan. En förteckning över gener samlades in efter litteratursökning88,89. För anrikning av genuppsättningar beaktades endast högt uttryckta gener för att minska bruset (mer än 500 UMIs i alla celler). Samma analys utfördes för att jämföra immunceller från hjärtat i vår studie med observationer från tidigare studier om hjärtresistenta makrofager51, vävnadsremodellerande makrofager från musvävnad45 och ursprung från gulesäckens linje90.

Statistik och reproducerbarhet

Alla analyser utfördes med hjälp av R Software, v.3.6.1. Students t-test användes för att jämföra fördelningen av celltyper på varje plats. P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Linjära regressionsmodeller (korrelationer) erhölls med hjälp av R-funktionen linjär modell (lm), som uppskattar den statistiska sannolikheten (P-värde) för ett linjärt samband. Bonferroni-korrigering tillämpades för multipel testning.

De avbildade RNAscope-mikrograferna i figurerna är representativa. Mikrograferna i figurerna 2g, 3c, h och Extended Data Fig. 3c (HAMP), Extended Data Fig. 3e (CNN1), Extended Data Fig. 4g, m, 6f upprepades med liknande resultat i två enskilda vävnadssektioner. Mikrograferna i figurerna 2h, 3f och Extended Data Fig. 3c (CNN1), Extended Data Fig. 3e (PCDH7), Extended Data Fig. 6e, h, 9d upprepades med liknande resultat i tre enskilda vävnadssektioner. Mikrograferna i figurerna 1e, 2d, 3e och de utökade uppgifterna i figurerna 1f, 3c (FHL1) och de utökade uppgifterna i figur 6d upprepades med liknande resultat i fyra enskilda vävnadssektioner. Mikrograferna i fig. 2c och Extended Data Fig. 3c (PRELID2), Extended Data Fig. 10e, 12a upprepades med liknande resultat i sex eller fler enskilda vävnadssektioner. Positiva och negativa kontroller gjordes en gång per använt prov.

GWAS-anrikningsanalys

Vi hämtade GWAS-sammanfattningsstatistik från broad cvdi, EBI GWAS-katalogen och GWAS-atlas. Vi valde ut egenskaper med välstyrda GWAS (n > 5 000 och antal signifikanta loci >10). GWAS-datasetterna sammanfattas i kompletterande tabell 27. Genuttrycksdata för proteinkodande gener mappades till Entrez-gen-id:er och dessa genannoteringar användes på den mänskliga arvsmassan hg19/37. Vi använde endast genuttrycksdata från kärnor. Vi genomförde analysen som tidigare beskrivits64 i python och i R. De log-transformerade räkningarna (plus en pseudoräkning) användes för att beräkna genomsnittliga celltypsspecifika uttrycksprofiler. Vi utförde individuella magma-analyser för varje celltyp, och villkorade alltid med standardkovariater på gennivå (t.ex. genlängd) och genomsnittligt genuttryck över alla celler. Därefter tillämpade vi Benjamini-Hochberg-metoden och valde ut associationer mellan celltypegenskaper med FDR < 10 %. Dessa par utsattes sedan för villkorlig analys enligt tidigare beskrivning64 för att definiera ”oberoende”, ”gemensamt förklarade” och ”delvis gemensamt förklarade” associationspar (kompletterande tabell 28).

Fördelningar av spridda celler och isolerade kärnor

De olika förfarandena för att erhålla isolerade kärnor och spridda celler resulterade i signifikant olika fördelningar av celltyper (kompletterande tabell 29, Extended Data Fig. 2). Särskilt noterbart är att 30,1 % och 49,2 % av de isolerade kärnorna härrörde från förmaks- och ventrikelkardiomyocyter i förmaks- och ventrikelregionerna, medan dessa celler mestadels uteslöts från preparat av isolerade och CD45-selekterade celler (Kompletterande tabell 2).

Om man bortser från kardiomyocyter förblev fördelningen av celltyper som identifierats från isolerade kärnor och dispergerade celler distinkt (Kompletterande tabell 30). Även om 59,0 % av de spridda cellerna var EC, härstammade endast 15,7 % av kärnorna från EC. Däremot kom 64,2 % av kärnorna från FB (31,2 %) och pericyter (33,0 %), medan endast 17,1 % av de spridda cellerna var FB (2,3 %) och pericyter (14,8 %). Dessa skillnader kan återspegla känslighet hos EC-kärnor för isoleringsprocedurer eller motståndskraft hos pericyter och FB:er mot cellulär enzymatisk nedbrytning.

Trots skillnader i cellfördelning mellan isolerade kärnor och dispergerade celler var genuttrycksprofilerna för cellinjeceringarna någorlunda korrelerade (r > 0,4 för varje celltyp). För att ta itu med överensstämmelsen mellan de gener som fångats av celler och kärnor jämförde vi uttrycket av de viktigaste celltypmarkörerna från fig. 1c mellan de tre källorna (Extended Data Fig. 1c). Eftersom kärnor saknar cytoplasmatiskt RNA var uttrycket av vissa gener, särskilt immungenerna NKG7 och C1QA, lägre i kärnor än i celler. Trots detta var den allmänna trenden med avseende på markörgener konsekvent i de tre källorna, och samma gener skiljde enskilda celltyper åt oberoende av källan.

Närmare analys av kärlceller

PCP3_str innehöll ett liknande bidrag av celler och kärnor och hade en scrublet-poäng som låg under det strikta tröskelvärde som användes; trots detta var det genomsnittliga antalet gener och räknevärden i detta kluster högre än genomsnittet. Trots vår stränga kvalitetsfiltrering kan vi alltså inte utesluta möjligheten att det kan finnas dubbleringar i detta kluster. EC10_CMC-like och PC4_CMC-like samuttrycker EC- eller pericytgener med kardiomyocytmarkörer och ytterligare studier krävs för att förstå om de representerar tidigare okända celltillstånd eller dubbletter.

Observationerna av arteriella och venösa SMC stöds av tidigare studier, som förutspår att arteriella SMC är mer kontraktila och venösa SMC är mindre differentierade91.

EC3_cap berikar transkript som kodar för komponenter av AP1 (JUN och FOS), som medierar flera beslut om EC:s öde, inklusive svar på VEGF, inflammatoriska signaler och stresssignaler, och ATF3, en gen för adaptiv respons som induceras av olika signaler92,93,94.

Karakterisering av skelettmuskulatur

Vi samlade in interkostala skelettmuskelprover från fem friska individer, inklusive en donator med matchad hjärtvävnad, och profilerade transkriptomet av 35 665 enskilda celler och 39 597 enskilda kärnor. På samma sätt som i hjärtat gjorde kombinationen av celler och kärnor det möjligt för oss att fånga och upplösa viktiga cellinjer, inklusive kardiomyocyter, fibroblaster, endotelceller, glatta muskelceller, pericyter, myeloida och lymfoida immunceller och satellitceller (Extended Data Fig. 11a, b, Supplementary Table 31).

Fördjupade analyser av skelettmuskulaturens vaskulära celler identifierade tio distinkta populationer. Endotelcellerna visade fem kluster som var separerade utifrån sina respektive kärlbäddar med signaturer som liknar dem vi observerar i hjärtat. EC_cap uttrycker VWF och RGCC. Venösa EC_ven uttrycker ACKR1 och PLVAP, medan arteriella EC_art visar SEMA3G och HEY1, i linje med våra hjärtdata (Extended Data Fig. 11c, d, Supplementary Table 32).

Den övergripande fördelningen av vaskulära och stromala cellpopulationer i skelett- och hjärtmuskulatur var likartad, inklusive de arteriella och venösa egenskaperna hos EC:s. Skelettmuskulaturen innehöll dock ett enda SMC-kluster, vilket möjligen kan hänga samman med den mindre storleken på datasetet. I skelettmuskulaturen omfattade de förutspådda cell-cellinteraktionerna mellan EC_art och SMC:er NOTCH1/4-JAG1 samt JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH3, men inte JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH2, som härleddes i hjärtat (Extended Data Fig. 11e, f, Supplementary Table 33).

Kardiella immunceller

Med hjälp av den logistiska regressionsmodellen identifierade vi inte någon motsvarighet till de kardiella IL17RA+-monocyterna i SKM eller njurar, möjligen på grund av den lilla storleken på denna population.

Naiva T-celler (CD4+T_naive) som identifierades uttryckte CCR7 och SELL, vilket tyder på deras naiva och vävnadsresidenta karaktär95. Minnes-T-celler (CD8+T_tem) uttryckte BACH2, STAT4 och IL7R, som är associerade med långsiktigt immunminne96,97. Vi karakteriserade de lymfoida cellerna ytterligare med hjälp av scNym98 och tränade det med hjälp av publicerade data99,100. Den resulterande modellen tillämpades på våra immunceller från hjärtat och de celler som hade en förutsedd poäng som var högre än 0,8 ansågs vara troliga kandidater för nyannotering. Med hjälp av detta tillvägagångssätt identifierade vi kandidater för plasma-B-celler (109), dendritiska celler (645), inneboende lymfoida celler (89), MAIT T-celler (219), T-hjälperceller (80) T-regulatoriska celler (11), T-centrala minnesceller (103), γδ T-celler (30) och plasmocytoida dendritiska celler (27). Dessa annotationer kan hittas i annotationerna för kardiella immunobjekt under etiketten ”scNym” på www.heartcellatlas.org.

Rapporteringssammanfattning

För ytterligare information om forskningens utformning finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till den här artikeln.