2 Fysiologiska bevis för endozepiner
Syntesen av RO 15-1788 (eller flumazenil, FLZ), den första kända BZ-antagonisten (Hunkeler et al, 1981; Ramerstorfer, Furtmüller, Vogel, Huck, & Sieghart, 2010), underlättade en stor mängd forskning som stödde hypotesen att endogena ligander till BZ-bindningsstället existerar och är funktionellt relevanta in vitro och in vivo. Även om FLZ har varit ett värdefullt verktyg för identifiering av fysiologiska BZ-åtgärder har dess användning för detta ändamål begränsningar. Det har till exempel visats att FLZ kan utöva PAM-effekter i heterologiskt uttryckta GABAARs, särskilt vid höga koncentrationer (Ramerstorfer et al., 2010). Viktigt är att FLZ aldrig har visats ha NAM-effekter på heterologiskt uttryckta GABAARs, vilket tyder på att eventuella NAM-effekter av FLZ på GABA-medierad hämning sannolikt beror på antagonism av en endogen ligand.
In vitro-studier har föreslagit ett antal kretsar där endozepiner uttrycks konstitutivt och är fysiologiskt aktiva, vilket framgår av undertryckande effekter av FLZ på GABA-medierad hämning, främst genom en minskning av svarstiden. FLZ undertrycker till exempel IPSP(C)s i hippocampus (King, Knox, Dingledine, 1985; Krespan, Springfield, Haas, & Geller, 1984) och i neokortikala neuronala kulturer (Vicini et al., 1986). FLZ har visat sig undertrycka hämning i dentate gyrus granuleceller i pilocarpinmodellen för temporallobsepilepsi (Leroy, Poisbeau, Keller, & Nehlig, 2004) och undertrycka hämning i neokortikala pyramidala neuroner i skikt II/III (Ali & Thomson, 2008). Långtidspotentiering av inhiberande synapser i hippocampus CA1-området var förknippad med en ökning av IPSC-amplituden som undertrycktes av FLZ (Xu & Sastry, 2005). Senast har det visats att FLZ undertrycker synaptiska inhibitionsneuroner i den thalamiska retikulära kärnan (nRt, Christian et al., 2013), vilket tyder på att det finns en endozepin i denna kärna. Tillsammans stöder dessa studier med FLZ starkt förekomsten av endogen PAM-aktivitet i flera olika hjärnregioner, vilket tyder på att detta är en brett implementerad endogen modulatorisk mekanism i CNS.
Ett antal intressanta kliniska fynd är förenliga med FLZ-antagonism av endozepinfunktionen. Till exempel kan FLZ-behandling framkalla panikattacker hos patienter med panikstörning men inte hos friska kontroller (Nutt, Glue, Lawson, & Wilson, 1990). Det kan också framkalla större panikrespons hos kvinnor med premenstruell dysforisk störning jämfört med kontroller (Le Mellédo, Van Driel, Coupland, Lott, & Jhangri, 2000) och för att vända stupor i samband med hepatisk encefalopati (Als-Nielsen, Gluud, & Gluud, 2004; Baraldi et al., 2009). Tillsammans tyder dessa studier på en fysiologisk roll för en ackumulering av endozepiner i det extracellulära rummet, dvs. en fysiologisk uppbyggnad, i regleringen av ångest/panik. Dessutom rapporterades att serumnivåerna av ämnen som hämmar FLZ-bindning till hjärnmembranen hos råttor ökade två gånger under förlossning med spontana förlossningar, en effekt som inte sågs hos patienter som genomgick kejsarsnitt (Facchinetti, Avallone, Modugno, & Baraldi, 2006), vilket tyder på att fysiologiska tillstånd som förlossning kan orsaka endozepinackumulering.
Relevansen av dessa fynd för mänskliga epilepsipatienter förblir för närvarande okänd, eftersom bevisen för endozepinverkan hos epilepsipatienter inte är entydiga. FLZ kan framkalla anfall hos patienter, men åtminstone vissa patienter fick sannolikt BZ-behandling (Spivey, 1992). I en serie av 67 patienter som genomgick utvärdering före epilepsikirurgi (Schulze-Bonhage & Elger, 2000) provocerades till exempel anfall hos 8 (12 %) – alla hade tidigare behandlats med BZ. Fallrapporter tyder på försämring av anfall av FLZ hos spädbarn och äldre (McDuffee & Tobias, 1995; Thomas, Lebrun, & Chatel, 1993). De rapporterade effekterna av FLZ på kramper i djurstudier är också blandade. Hos råttor yngre än 2 veckor förvärrar FLZ mindre motoriska anfall inducerade av PTZ (Rathouská, Kubová, Mares, & Vorlícek, 1993). Särskilt i högdoskonvulsiva modeller har antingen undertryckande av anfallsaktivitet (Kaijima, Le Gal La Salle, & Rossier, 1983) eller ingen effekt (Hunkeler et al., 1981) rapporterats. I GAERS-modellen för genetisk spontan frånvaroepilepsi hade FLZ koncentrationsberoende effekter, där låga doser undertryckte spike-wave dischargings (SWD) och högre doser förstärkte dem (Marescaux et al., 1984). Dessutom har en genetisk mutation (R43Q) i den humana γ2-underenheten som är förknippad med både familjär frånvaro och feberanfall visat sig upphäva (Wallace et al., 2001) eller minska (Bowser et al., 2002) in vitro känsligheten hos specifika GABAARs för DZP. Mekanismen för ökad anfallsaktivitet i samband med receptorernas okänslighet för DZP, en exogen ligand, är ännu inte känd. En provocerande hypotes är att mutationen gör receptorerna okänsliga för en naturligt förekommande endogen BZ. Eftersom ett endogent BZ sannolikt skulle ha anfallshämmande egenskaper skulle mutationer i receptorn som förhindrar bindning av det endogena BZ förväntas orsaka anfall. Receptortrafiken påverkas dock också av denna mutation (Kang & Macdonald, 2004; Sancar & Czajkowski, 2004) och skulle kunna bidra till anfallsaktiviteten, så endozepinernas roll vid anfall relaterade till γ2R43Q-mutationen förblir kontroversiell.
FLZ har också rapporterats vända idiopatisk återkommande stupor (Rothstein et al, 1992), även om det på senare år har blivit uppenbart att åtminstone vissa patienter som svarade på FLZ hade smyganvändning av BZ (Granot, Berkovic, Patterson, Hopwood, & Mackenzie, 2004) och detta område är fortfarande kontroversiellt (Cortelli et al., 2005). I en nyligen genomförd studie normaliserade FLZ vaksamheten hos en välkaraktäriserad grupp patienter med hypersomni. En peptidergisk PAM-aktivitet hittades i cerebrospinalvätska (CSF) hos dessa patienter (Rye et al., 2012). PAM interagerade dock inte med en potentiering av BZ midazolam och kvarstod delvis i α1(H101R), GABAARs med en punktmutation som gör dem BZ-okänsliga, vilket tyder på att det kanske inte är ett klassiskt BZ-mimiknande medel (Rye et al., 2012). Identiteten hos denna CSF PAM och dess roll i hypersomniens patofysiologi är fortfarande okänd.