Efectele în timp și în doză ale aportului de cafeină asupra receptorilor de adenozină A2A din trombocite umane

Cafeina, care se găsește în diferite surse, cum ar fi cafeaua, ceaiul, ciocolata și băuturile de cola, este cea mai răspândită substanță activă din lume. Consumul mediu de cofeină de către oamenii adulți variază, în funcție de diferite culturi și națiuni, de la 80 la 400 mg pe persoană pe zi.1 Cofeina determină un număr divers de răspunsuri farmacologice, inclusiv creșterea vigilenței, scăderea timpului de reacție psihomotorie și creșterea latenței somnului și a timpului de trezire și poate influența, de asemenea, performanța intelectuală.2 Mai mult, cofeina determină relaxarea mușchilor netezi, sporește secreția de acid gastric și eliberarea de catecolamine și crește activitatea metabolică.3

Mecanismul (mecanismele) exact(e) care stă (stau) la baza acțiunilor cofeinei rămâne (rămân) slab definit(e). Deși inhibarea fosfodiesterazelor poate contribui la acțiunile cofeinei,4 există tot mai multe dovezi că majoritatea efectelor farmacologice ale acestei xantine rezultă din antagonismul receptorilor de adenozină desemnați ca subtipuri A1, A2A, A2B și A3.5 Cofeina acționează cel mai puternic la receptorii A2A, urmată îndeaproape de receptorii A1, apoi de receptorii A2B,6 și ca un antagonist slab la receptorii A3 umani. Blocarea de către cofeină a receptorilor de adenozină, și anume a tipurilor de receptori A1 și A2A, inhibă acțiunea adenozinei endogene asupra unei varietăți de procese fiziologice.7 În condiții normale, nivelurile sanguine de adenozină par a fi suficiente pentru a activa tonic receptorii A2A din trombocite. Recent, la șoarecii cu receptor A2A-knock-out, s-a raportat că agregarea plachetară a fost crescută, ceea ce indică importanța acestui subtip de receptor în funcția plachetară.8 Prin urmare, este de conceput că cafeina ar putea să blocheze acești receptori A2A activați tonic în trombocite și să le modifice funcțiile modulate de adenozină.

De mai mulți ani, s-a suspectat o asociere între consumul de cafea și bolile cardiovasculare, în special bolile coronariene,9 dar recent s-a demonstrat că consumul de cafea sau cafeină nu crește riscul de boli coronariene sau de accident vascular cerebral.1011 Numeroase studii epidemiologice care au luat în considerare infarctul miocardic nu au constatat niciun efect nociv al <5 cești de cafea pe zi, în timp ce rezultatele sunt controversate la niveluri mai ridicate de consum.12 La pacienții cu hipertensiune arterială, nu s-a observat niciun risc de rezultate adverse la niciun nivel de consum de cafeină.13

Un studiu realizat de Biaggioni et al14 a constatat că un regim de dozare repetată de cofeină duce la modificări semnificative la trombocitele umane în ceea ce privește răspunsurile funcționale la agonistul receptorului de adenozină 5′-N-etilcarboxamidoadenozină (NECA). Retragerea cafeinei a produs o deplasare semnificativă spre stânga a inhibării agregării induse de NECA.14 În concordanță cu acest lucru, am demonstrat recent,15 la subiecții tratați cu 750 mg/zi timp de 1 săptămână, că aportul cronic de cofeină modifică agregabilitatea plachetară ca urmare a creșterii numărului de receptori A2A localizați pe suprafața plachetară.

În articolul de față, aducem dovezi suplimentare că un răspuns similar se găsește la subiecții tratați cu cofeină în doze diferite, cum ar fi 600 mg/zi timp de 1 săptămână sau 400 mg/zi, administrate pentru o perioadă mai lungă de timp, cum ar fi 2 săptămâni. În studiul de față, acest lucru a fost realizat prin măsurarea directă a modificărilor receptorilor de adenozină A2A (densitate și afinitate) și a funcției acestora prin determinarea efectului agonistului selectiv A2A 2-hexinil-NECA (HE-NECA) pentru (1) creșterea acumulării de AMPc, (2) inhibarea agregării plachetare și (3) scăderea nivelului de calciu intracelular. După consumul cronic (600 mg/zi timp de 1 săptămână sau 400 mg/zi timp de 2 săptămâni), s-a constatat o suprareglare a receptorilor de adenozină A2A plachetară, care a fost puternic corelată cu efectele antiagregante, o creștere a acumulării de AMPc și o scădere a nivelului de calciu intracelular. Nu au fost evidențiate diferențe privind parametrii de legare și funcționali la subiecții tratați cu 400 mg/zi timp de 1 săptămână.

Metode

Au fost studiați 45 de subiecți sănătoși, nefumători, cu vârste cuprinse între 25 și 45 de ani, de ambele sexe. După ce și-au dat consimțământul informat în scris, subiecții au fost rugați să se abțină de la metilxantinele alimentare timp de ≥2 săptămâni. Aceștia au fost împărțiți în 3 grupe (15 subiecți fiecare) în funcție de regimul de administrare a cafeinei (adică doza și durata administrării): 200 mg pe cale orală de 2 ori pe zi pentru o perioadă de 7 zile (grupa 1); 200 mg pe cale orală de 2 ori pe zi pentru o perioadă de 14 zile (grupa 2); și 200 mg pe cale orală de 3 ori pe zi pentru o perioadă de 7 zile (grupa 3). Trombocitele de la acești subiecți au fost studiate înainte de a începe cafeina (ziua 0) și la 1, 12, 60 și 108 ore după ultima doză de cafeină. În special, punctul de timp de 1 oră a fost studiat doar în grupul care a primit doza maximă de cafeină (600 mg/zi). EC50 și IC50 în testele funcționale nu au putut fi obținute la 1 oră din cauza problemelor practice legate de prelevarea excesivă de sânge într-o perioadă de timp restrânsă (1 până la 12 ore).

SCH 58261 Binding Assay in Human Platelet Membranes

Membranele din trombocite umane au fost preparate așa cum a fost descris anterior16 și utilizate pentru testele de legare a radioligandului cu SCH 58261 în conformitate cu Varani și colab.17 În studiile de saturație, membranele de trombocite umane au fost incubate cu 8 până la 10 concentrații diferite de SCH 58261 variind de la 0,01 la 10 nmol/L. Legarea nespecifică a fost determinată în prezența NECA 10 μmol/L. După 60 de minute de incubare la 4°C, probele au fost filtrate prin filtre Whatman GF/B cu ajutorul unui Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co). Pentru analiza computerizată a datelor din experimentele de saturație a fost utilizat un program de ajustare a curbelor cu cele mai mici pătrate neliniare ponderate, LIGAND,18.

Măsurarea nivelurilor de AMPc în trombocitele umane

Plachetele umane spălate obținute din sângele periferic al voluntarilor sănătoși au fost preparate așa cum a fost descris anterior.16 Plachetele (6×104 până la 8×104 celule) au fost incubate cu 1,0 U de adenozină deaminază/mL, 0,5 mmol/L 4-(3-butoxi-4-metoxibenzil)-2-imidazolidinonă (Ro 20-1724) ca inhibitor de fosfodiesterază și 6 până la 8 concentrații diferite de HE-NECA. Valorile EC50 au fost obținute din curbele concentrație-răspuns după transformarea log-logit a variabilelor dependente printr-o metodă ponderată a celor mai mici pătrate.19 Soluția apoasă finală a fost testată pentru nivelurile de AMPc printr-un test de legare a proteinelor de competiție.15

Test de agregare a trombocitelor

Sângele uman chitrat a fost centrifugat la 200 g timp de 10 minute pentru a obține plasmă bogată în trombocite și la 2500 g timp de 20 de minute pentru a obține plasmă săracă în trombocite. Numărătoarea trombocitelor umane a fost efectuată într-un contor Coulter model S8/80 (Coulter Electronics Inc) și ajustată la 2,5×108/mL până la 3,5×108/mL cu plasmă autologă săracă în trombocite. Agregarea plachetară a fost realizată în conformitate cu tehnica turbidimetrică Born20 cu un agregator DIC PA-3220 Aggrecorder (Kyoto Daiichi Kagatu Co). După incubarea timp de 3 minute cu 6 până la 8 concentrații diferite de HE-NECA, plasma bogată în trombocite a fost agregată la 37°C sub agitare continuă cu ADP. Experimente similare au fost efectuate cu ADP la diferite concentrații (100 nmol/L până la 100 μmol/L). Agregarea maximă, înregistrată la 5 minute după adăugarea de ADP, a fost utilizată pentru analiza cantitativă, iar procentul de inhibiție a fost calculat în raport cu valorile de control.21

Măsurători ale concentrației de Ca2+ liber citoplasmatic

Concentrația de calciu liber citoplasmatic a fost măsurată prin utilizarea tehnicii fura 2 conform Paul și colab.22 Pe scurt, trombocitele au fost incubate în întuneric total timp de 30 de minute la 37°C cu 1 μmol/L fura 2-AM și agitate magnetic în cuve fluorimetrice (LS50, Perkin Elmer, Ltd) la o concentrație de 108/mL în prezența a 250 μmol/L sulfinpirazonă. Concentrația intracelulară de Ca2+ (i) a fost determinată la un raport de excitație de 340/380 și o lungime de undă de emisie de 505 nm.

Analiză statistică

Analiza datelor a fost efectuată prin ANOVA cu 1 cale. Analiza diferențelor dintre grupurile tratate cu cafeină (12, 60 și 108 ore) și subiecții de control a fost efectuată cu testul t al lui Student (analiză nepereche). Diferențele au fost considerate semnificative la o valoare de P<0,01. Toate datele sunt raportate ca medie±SEM.

Rezultate

Plachetele de la cele 3 grupuri de subiecți au fost recoltate înainte de începerea administrării de cafeină (ziua 0, control) și la 1, 12, 60 și 108 ore după ultima doză (retragerea cafeinei). Tabelul rezumă rezultatele experimentelor de legare și funcționale de la cele 3 grupuri de subiecți.

Grupa 1 (400 mg/zi timp de 1 săptămână)

Parametrii de legare au evidențiat o valoare Bmax de control de 105±6 fmol/mg de proteină și o valoare KD de 1,28±0,08 nmol/L. În trombocitele de control, HE-NECA a crescut nivelul de AMPc cu o EC50 de 60±5 nmol/L și a inhibat (1) agregarea cu o IC50 de 86±10 nmol/L și (2) nivelul de calciu cu o IC50 de 104±8 nmol/L. Nu s-au constatat diferențe semnificative din punct de vedere statistic în ceea ce privește parametrii de legare și funcționali la 12, 60 și 108 ore după retragerea cafeinei (tabel).

Grupa 2 (400 mg/zi timp de 2 săptămâni)

Parametrii de legare au evidențiat o valoare Bmax de control de 110±3 fmol/mg de proteină și o valoare KD de 1,21±0,09 nmol/L. La 12 și 60 de ore după retragerea cafeinei, densitățile receptorilor, Bmax, au crescut la ambele momente cu aproximativ 20%, dar valorile KD au rămas neschimbate. Experimentele funcționale au arătat că agonistul HE-NECA al receptorului de adenozină A2A a fost semnificativ mai puternic în creșterea AMPc plachetar (adică, valorile EC50 au fost cu 45% și, respectiv, 65% mai mici la 12 și, respectiv, 60 de ore după retragerea cafeinei decât valorile de control). O tendință similară a fost observată în valorile IC50 obținute în experimentele de agregare și în măsurătorile concentrației de calciu liber citoplasmatic (tabel).

Grupa 3 (600 mg/zi timp de 1 săptămână)

În general, am obținut date similare cu cele din grupa 2. SCH 58261 s-a legat la o singură clasă de afinitate a situsurilor din membranele trombocitelor provenite de la controale cu o Bmax de 100±4 fmol/mg de proteină și o KD de 1,27±0,09 nmol/L. După cum se arată în figura 1A, în membranele de la trombocite recoltate la 1, 12, 60 și 108 ore după retragerea cafeinei, radioligandul s-a legat cu aceeași afinitate, dar numărul de situsuri de legare (Bmax) a crescut semnificativ (P<0,01). În cadrul unor studii paralele, au fost determinate răspunsurile funcționale ale trombocitelor la agonistul HE-NECA al receptorului A2A. După cum se rezumă în tabel, potența HE-NECA de a (1) crește formarea de AMPc, (2) inhiba agregarea plachetară indusă de ADP și (3) reduce nivelul de calciu a fost semnificativ crescută în trombocite obținute la 12, 60 și 108 ore după retragerea cafeinei (Figura 1B, 1C și 1D). Experimentele au fost efectuate, de asemenea, pentru a determina dacă creșterea densității receptorilor A2A ar fi însoțită de o scădere a potenței și/sau eficienței ADP de a induce agregarea. Valorile EC50 ale ADP pentru a stimula agregarea plachetară la 12, 60 și 108 ore după retragerea cafeinei au fost de 0,7±0,2, 0,9±0,1 și, respectiv, 0,8±0,1 μmol/L, valori care nu diferă semnificativ de cele de 0,9±0,0.2 μmol/L obținute în trombocitele de la martori (figura 2).

Discuție

Efectele administrării pe termen lung a cofeinei la oameni și animale și rolul acesteia în toleranța lor la acțiunile cofeinei sunt controversate. Unele studii care au evidențiat o creștere a receptorilor A1 în creierul de șoarece au găsit dovezi pentru o upreglare dependentă de doză a receptorilor A1 de către cofeină.23 Alte studii au evidențiat o upreglare a receptorilor A2A, sugerând un efect adaptativ al consumului de cofeină.24 Mai mult, consumul cronic de cofeină poate duce la o reducere a agregabilității plachetare ca urmare a upreglementării receptorilor A2A localizați pe suprafața plachetară14 , jucând un rol potențial în procesele fiziopatologice, cum ar fi agregarea și trombogeneza. Deși astfel de modificări pot contribui la alterarea funcției plachetare, toleranța la cofeină nu modifică potența acestei xantine ca antagonist competitiv al efectelor adenozinei.25 În fenomenul de toleranță pot fi implicate și alte modificări, cum ar fi trecerea afinității receptorilor la o stare de mare afinitate, alterarea nivelului proteinelor G sau a cuplării acestor proteine cu receptorii de adenozină sau ocuparea pe termen lung a receptorilor.26 Simptomele de sevraj la cofeină apar la om; în mod obișnuit, acestea sunt dureri de cap, oboseală, apatie și somnolență.9 În special, cofeina crește concentrația plasmatică de adenozină, iar reducerea acesteia după retragerea antagonistului sugerează reglarea mediată de receptori a concentrației plasmatice de adenozină.27 În timpul ischemiei și/sau hipoxiei, adenozina are, de asemenea, acțiuni neuroprotectoare. În creierul adult, tratamentul cronic cu cofeină, care duce la creșterea receptorilor de adenozină, reduce leziunile ischemice, în timp ce expunerea acută (efect antagonist al receptorilor) crește leziunile ischemice.28

S-a demonstrat că aportul cronic de cofeină modifică răspunsul plachetelor la acțiunile adenozinei.14 Administrarea repetată de cofeină (750 mg/zi timp de 1 săptămână) a evidențiat o creștere a densității receptorilor A2A, însoțită de sensibilizarea răspunsurilor plachetare, cum ar fi creșterea acumulării de AMPc și scăderea agregării plachetare.15 Scopul prezentului studiu a fost de a determina efectul dozei de cofeină și al duratei de administrare asupra parametrilor de legare și funcționali. Astfel, am studiat modificările densității și afinității receptorilor de adenozină A2A în membranele plachetare umane ale subiecților tratați cu diferite doze (400 sau 600 mg/zi) pentru diferite perioade de administrare a cafeinei (1 sau 2 săptămâni). Mai exact, am studiat subiecți de control (înainte de administrarea cafeinei) și subiecți tratați cu cofeină (la 1, 12, 60 și 108 ore după ultima doză de cofeină).

Tratamentul cu 400 mg/d de cofeină timp de 1 săptămână nu a modificat parametrii funcționali și de legare a receptorilor A2A. Cu toate acestea, tratamentul cu 400 mg/d timp de 2 săptămâni sau 600 mg/d timp de 1 săptămână a dus la (1) o creștere semnificativă (upregulation) a situsurilor de legare a adenozinei A2A, (2) o creștere a acumulării de AMPc, (3) o creștere a efectelor antiagregante și (4) o scădere a nivelurilor de calciu declanșate de agonistul receptorului A2A HE-NECA.

Urgenizarea receptorilor A2A poate fi probabil atribuită sintezei de noi receptori în timpul diferențierii celulelor precursoare. Această interpretare se bazează pe rezultatele experimentelor in vitro care arată că incubarea plasmei bogate în trombocite de la subiecții de control pentru o perioadă de 6 sau 12 ore cu cafeină sau SCH 58261 nu a afectat parametrii de legare.15 Creșterea receptorilor de adenozină A2A cauzată de consumul cronic de cofeină ar putea fi interpretată pentru a indica faptul că adenozina endogenă are o influență tonică asupra trombocitelor umane, iar prezența antagonistului este contrabalansată de creșterea receptorilor A2A. La adulți, cofeina este adsorbită eficient din tractul gastrointestinal; concentrațiile plasmatice maxime apar la 15 până la 120 de minute după ingestie, iar timpul de înjumătățire al cofeinei este de 2,5 până la 4,5 ore.7 Creșterea receptorilor de adenozină A2A constatată la 1 oră după ultima doză de tratament cu cofeină a fost similară cu cea obținută la 12 sau 60 de ore după retragerea cafeinei, ceea ce arată că retragerea nu a fost necesară pentru upreglarea receptorilor A2A.

Un alt scop al prezentului studiu a fost acela de a determina dacă modificările parametrilor de legare s-au corelat cu modificările răspunsului (răspunsurilor) funcțional(e). S-a constatat că agregarea plachetară a fost asociată cu activarea adenilatciclazei și cu o creștere a concentrațiilor de calciu intracelular. Puterea HE-NECA la 12, 60 și 108 ore după retragerea cafeinei a fost semnificativ crescută în comparație cu grupul de control. Această constatare indică faptul că administrarea repetată a diferitelor doze de cofeină duce la modificări semnificative ale numărului de receptori A2A de pe suprafața plachetară, însoțite de o sensibilitate sporită la stimularea receptorilor. Receptorul clasic al adenozinei A2A este responsabil pentru proprietățile antiagregante ale adenozinei și ale analogilor săi, ceea ce este în concordanță cu observația că agregarea este mai eficientă la șoarecii lipsiți de receptorii A2A.8 Cu toate acestea, agregarea plachetară indusă de concentrații crescânde de ADP nu a fost semnificativ diferită între subiecții de control și cei tratați cu cafeină. O posibilă explicație pentru această ultimă observație este că nu există suficientă adenozină în mediul de testare pentru a produce un răspuns. Alternativ, la subiecții tratați cu cafeină, magnitudinea de creștere a receptorilor (adică numărul de receptori) nu a fost suficientă pentru a produce o deplasare a curbei concentrație-răspuns a agregării induse de ADP. Cu toate acestea, atunci când nivelurile de adenozină endogenă cresc, cum ar fi în timpul ischemiei miocardice, concentrația extracelulară de adenozină crește rapid până la un nivel suficient pentru a acționa asupra receptorilor suprareglați și poate avea efecte inhibitorii plachetare mai mari decât cele de control. Astfel, este posibil ca un consum cronic de cofeină în doze nu foarte îndepărtate de aportul alimentar mediu să conducă la o reducere paradoxală a agregabilității plachetare în timpul ischemiei.

În concluzie, toate datele reunite oferă dovezi suplimentare că aportul cronic de cofeină modifică răspunsul trombocitelor la acțiunile adenozinei. Descoperirea majoră a studiului de față este că efectele consumului cronic de cofeină asupra funcțiilor plachetare sunt dependente atât de doza cât și de durata tratamentului și stau la baza unei reduceri a agregabilității plachetare datorate supraregularizării receptorilor A2A ai adenozinei.

Note de subsol

.