Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este o formă de cromatografie pe coloană care pompează un amestec de probe sau un analit într-un solvent (cunoscut sub numele de fază mobilă) la presiune ridicată printr-o coloană cu material de umplutură cromatografică (fază staționară). Proba este transportată de un flux de gaz purtător mobil de heliu sau azot. HPLC are capacitatea de a separa și de a identifica compușii care sunt prezenți în orice probă care poate fi dizolvată într-un lichid în concentrații de urme de până la părți pe trilion. Datorită acestei versatilitati, HPLC este utilizat într-o varietate de aplicații industriale și științifice, cum ar fi cele farmaceutice, de mediu, criminalistice și chimice.
Timpurile de retenție ale probelor variază în funcție de interacțiunea dintre faza staționară, moleculele analizate și solventul, sau solvenții utilizați. Pe măsură ce proba trece prin coloană, aceasta interacționează între cele două faze la viteze diferite, în principal din cauza diferitelor polarități ale analiților. Analiții care au cea mai mică cantitate de interacțiune cu faza staționară sau cea mai mare cantitate de interacțiune cu faza mobilă vor ieși mai repede din coloană.
Instrumentație:
Componentele principale ale unui sistem HPLC includ rezervorul de solvent, sau mai multe rezervoare, o pompă de înaltă presiune, o coloană, sistemul de injecție și detectorul.
Limita de detecție |
Recomandarea gazului |
Recomandarea regulatorului |
| Gaz de purjare | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Heliu 5.0 | BASELINE seria C106 |
Rezervorul conține solventul, care se numește fază mobilă, deoarece se mișcă. De obicei, există cel puțin două rezervoare într-un sistem, fiecare dintre ele conținând până la 1000 cc de solvent și fiind, de obicei, prevăzut cu un difuzor de gaz prin care poate fi barbotat heliu. Se utilizează o pompă pentru a genera un debit specificat de fază mobilă. Deși injectarea manuală a probelor este încă posibilă, majoritatea HPLC-urilor sunt în prezent complet automatizate și controlate de un computer. Injectorul, sau prelevatorul automat de probe, introduce solventul într-un flux de fază care transportă proba în coloana de înaltă presiune (până la 400 bar), care conține materialul de ambalare specific necesar pentru a efectua separarea. Materialul de împachetare este denumit fază staționară, deoarece este ținut în poziție de hardware-ul coloanei.
Este necesar un detector pentru a vedea benzile de compuși separați pe măsură ce se eluează din coloana de înaltă presiune. Informația este trimisă de la detector la un calculator care generează cromatograma. Faza mobilă iese din detector și este fie trimisă la un deșeu, fie colectată, după cum se dorește.
Spargerea cu heliu este o metodă eficientă de degazare a fazei mobile pentru a evita liniile de bază instabile cauzate de aerul dizolvat. Azotul este utilizat ca gaz de nebulizare în detectorul de împrăștiere a luminii prin evaporare (ELSD), în care solventul este evaporat din eșantion lăsând o ceață în timp ce este măsurat.
Cromatografie lichidă de înaltă performanță – Alte tipuri de HPLC
Cromatografie lichidă de ultra înaltă performanță (uHPLC):
În timp ce HPLC standard utilizează în mod obișnuit particule de coloană cu dimensiuni cuprinse între 3 și 5µm și presiuni de aproximativ 400 bar, uHPLC utilizează coloane special concepute cu particule cu dimensiuni de până la 1,7µm, la presiuni de peste 1000 bar. Principalul avantaj al unui uHPLC este viteza. Aceste sisteme sunt mai rapide, mai sensibile și se bazează pe volume mai mici de solvenți organici decât HPLC-ul standard, ceea ce duce la posibilitatea de a analiza mai multe probe în mai puțin timp. Cu toate acestea, dacă sistemele sunt rulate la presiuni tipice mai mari de 800 bar, coloanele îmbătrânesc sau se degradează mai repede. O tehnologie mai nouă este în curs de dezvoltare pentru unitățile uHPLC pentru a utiliza particule de coloană cu dimensiuni de 1µm și cu potențiale de presiune de până la 6.800 bar.
uHPLC este cunoscută și sub denumirea de UPLCTM, o marcă comercială a Waters Corporation.
Cromatografia lichidă rapidă a proteinelor (FPLC):
FPLC este un sistem similar cu cromatografia lichidă de înaltă performanță care este utilizat pentru a separa sau purifica proteinele și alte biomolecule din amestecuri complexe. Principala diferență între FPLC și HPLC este presiunea de lucru standard. Coloanele FPLC pot fi utilizate doar până la presiuni maxime de 3-5 MPa. Dacă presiunea HPLC poate fi limitată, aproape toate coloanele FPLC pot fi utilizate și într-un sistem HPLC.
.