Celule ale inimii umane adulte

Raportarea datelor

Nici o metodă statistică nu a fost folosită pentru a determina în prealabil mărimea eșantionului. Experimentele nu au fost randomizate, iar investigatorii nu au fost orbiți în ceea ce privește alocarea în timpul experimentelor și evaluarea rezultatelor.

Etica cercetării pentru țesuturile donatorilor

Tesuturile cardiace (donatori D1-D7 și D11) au fost procesate la Wellcome Sanger Institute (Hinxton, Marea Britanie) și obținute de la donatori decedați de organe pentru transplant după aprobarea Comitetului de Etică a Cercetării (ref 15/EE/0152, Comitetul de Etică a Cercetării East of England Cambridge South) și consimțământul informat din partea familiilor donatorilor. Țesuturile cardiace (donatori H2-H7) au fost prelucrate la Harvard Medical School (Boston, Massachusetts, SUA) și au fost obținute de la donatori de organe decedați după aprobarea Comitetului de etică a cercetării umane Pro00011739 (University of Alberta, Edmonton, Canada). Consimțământul în cunoștință de cauză din partea familiilor donatorilor a fost obținut prin intermediul programului instituțional Human Organ Procurement and Exchange Program (HOPE). Anamneza cardiovasculară a fost neremarcabilă pentru toți donatorii (tabelul suplimentar 1).

Achiziționarea și prelucrarea țesuturilor

Tesuturile au fost achiziționate de la donatori din Marea Britanie și America de Nord (D1-7 și 11, H2-7) după moarte circulatorie (DCD) (D2, D4-D7 și D11) și după moarte cerebrală (DBD) (D1, D3, H2-H7). Pentru donatorii cu DCD din Regatul Unit, după o perioadă de așteptare de cinci minute și pentru DBD, se deschide toracele, se clampează aorta și se prelevează probe cardiace. Pentru donatorii nord-americani de DBD, aorta este blocată, se administrează cardioplegie rece (Celsior) sub presiune prin aortă pentru a opri bătăile, inima este extirpată, clătită în soluție salină rece și se prelevează probe. Toate probele prelevate de la donatori au fost biopsii miocardice de grosime totală din atriul stâng și drept, ventriculul stâng și drept, septul interventricular și apexul, cu excluderea intenționată a depozitelor mari de grăsime epicardică. Probele utilizate pentru izolarea nucleelor unice au fost congelate rapid și depozitate la -80 °C. Izolarea nucleelor unice și îmbogățirea CD45+ au fost efectuate pe probe proaspăt recoltate. Țesutul rezidual după procedurile de izolare a nucleilor și a celulelor a fost fixat în formol sau congelat în OCT pentru studii suplimentare.

Toate țesuturile au fost depozitate și transportate pe gheață în permanență până la congelare sau disocierea țesutului pentru a minimiza orice degradare transcripțională. Studiile anterioare privind stabilitatea tisulară post-mortem a consorțiului GTEx pe țesuturi în vrac68 și în celule unice69 sugerează doar modificări minore în țesuturi în primele 24 de ore post-mortem atunci când sunt depozitate în condiții de frig.

Insolarea nucleilor unici

Nucleii unici au fost obținuți din țesuturi congelate instantaneu prin omogenizare mecanică, așa cum a fost descris anterior70. Țesuturile au fost omogenizate folosind un set de măcinător de țesuturi Dounce din sticlă de 7 ml (Merck) cu 8-10 lovituri ale unui pistil liber (A) și 8-10 lovituri ale unui pistil strâns (B) în tamponul de omogenizare (250 mM zaharoză, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1× inhibitor de protează, 0.4 U μl-1 RNaseIn, 0,2 U μl-1 SUPERaseIn, 0,1 % Triton X-100 în apă fără nucleaze). Omogenatul a fost filtrat printr-un filtru celular de 40 μm (Corning). După centrifugare (500g, 5 minute, 4 °C), s-a îndepărtat supernatantul și s-a resuspendat granula în tamponul de stocare (1× PBS, 4% albumină serică bovină (BSA), 0,2 U μl-1 Protector RNaseIn). Nucleii au fost colorați cu reactivi NucBlue Live ReadyProbes (ThermoFisher), iar nucleele unice pozitive la Hoechst au fost purificate prin sortare celulară activată prin fluorescență (FACS) utilizând influx, XDP sau FACSAria (BD Biosciences) (figura suplimentară 1). Purificarea nucleelor și integritatea acestora a fost verificată la microscop, iar nucleele au fost prelucrate în continuare cu ajutorul Chromium Controller (10X Genomics) în conformitate cu protocolul producătorului.

Preparare monocelulară

Tesuturi cardiace (0.2-0,9 g) au fost transferate din soluția cardioplegică în tuburi CMACS blânde (Miltenyi Biotec) care conțin o soluție de bază de digestie enzimatică (100 μg ml-1 liberase TH Research grade și 50 μg ml-1 DNază I, HBSS 10 mM HEPES și 30 mM taurină)71. Țesuturile au fost tocate cu o foarfecă (FST) și au fost digerate automat cu ajutorul dispozitivului de disociere Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) gentleMACS (Miltenyi Biotec) cu încălzitoare. Suspensia unicelulară sărăcită de cardiomiocite a fost spălată cu soluție de bază care conține 20% ser fetal bovin (FBS) (Gibco), filtrată printr-un filtru de nailon de 70 μm (BD Falcon), colectată prin centrifugare (330g, 10 min, 4 °C) și resuspendată în soluție de bază care conține 0,2% FBS (Gibco). Celulele au fost numărate manual de trei ori prin excludere cu albastru Trypan după fiecare centrifugare și au fost resuspendate la o concentrație de cel puțin 2 × 106 ml-1 . Celulele unice au fost procesate cu ajutorul Chromium Controller (10X Genomics) în conformitate cu protocolul producătorului.

Îmbogățirea celulelor CD45+

Suspensia celulară a fost preparată conform descrierii de mai sus și ulterior marcată cu ajutorul microbilelor conjugate cu anticorp monoclonal anti-CD45 uman conform protocolului producătorului (Miltenyi Biotec). Pe scurt, până la 107 celule au fost incubate timp de 15 minute la 4 °C în 80 μl de tampon PBS, BSA, EDTA (1× PBS pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) conținând 20 μl de microbile CD45. Suspensia celulară a fost spălată o dată în soluție tampon PBS, BSA, EDTA și colectată prin centrifugare (330 g, 10 minute, 4 °C). Celulele resuspendate au fost aplicate pe coloanele MACS LS (Miltenyi Biotec). Fracția de celule CD45 a fost eliminată după trei spălări cu PBS, BSA și tampon EDTA, iar fracția de celule CD45+ a fost colectată în PBS, BSA și tampon EDTA prin îndepărtarea coloanelor din câmpul magnetic. Celulele CD45+ au fost numărate și resuspendate în PBS, BSA și tampon EDTA până la o concentrație de cel puțin 2 × 106 pe ml înainte de procesarea ulterioară cu ajutorul unui controler Chromium (10X Genomics) în conformitate cu protocolul producătorului.

Prepararea bibliotecii Chromium 10X

Celele individuale și nucleele au fost numărate manual prin excludere cu albastru Trypan sau automat cu ajutorul unui Countess II (Life Technologies) folosind cel puțin două numărători separate. Suspensia de celule sau nuclee a fost ajustată la 400-1.000 de celule pe microlitru și încărcată pe controlerul Chromium (10X Genomics) cu o recuperare de celule sau nuclee țintită de 4.000-10.000 de celule sau nuclee pe reacție. 3′ bibliotecile de expresie genetică au fost pregătite în conformitate cu instrucțiunile producătorului kiturilor de reactivi Chromium Single Cell Reagent v2 sau v3 (10X Genomics). Controlul calității ADNc și a bibliotecilor finale a fost realizat cu ajutorul Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent) sau al sistemului 4200 TapeStation (Agilent). Bibliotecile au fost secvențiate folosind HiSeq 4000 (Illumina) la Wellcome Sanger Institute și NextSeq 500 (Illumina) la Harvard Medical School, cu o adâncime minimă de 20 000-30 000 de perechi de citire per celulă sau nucleu (tabelul suplimentar 22).

Validare spațială utilizând smFISH cu sonde RNAscope

În timpul pregătirii probelor fixate în formol și încorporate în parafină (FFPE), țesutul proaspăt a fost fixat în formol neutru tamponat cu 10% timp de 18-36 h și ulterior încorporat în blocuri de parafină. Probele de țesut fixate-congelate au fost fixate în paraformaldehidă 4% (ThermoFisher). Secțiunile au fost tăiate la o grosime de 5 μm cu ajutorul unui microtometru și au fost plasate pe lame SuperFrost Plus (VWR). Lamele de țesut FFPE au fost colorate automat folosind BOND RX (Leica) și RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Assay (ACDBio) în conformitate cu protocolul producătorului. Lamele de țesut fixate-congelate au fost prelucrate în conformitate cu protocolul RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v1 (ACDBio). Sondele țintă RNAscope gata pregătite sau făcute la comandă au fost rulate în paralel cu controalele multiplex pozitive și negative (Extended Data Fig. 12b, tabelul suplimentar 23). Toate nucleele au fost colorate cu DAPI. Toate lamelele de țesut FFPE au fost imaginate cu ajutorul unui sistem confocal de screening Opera Phenix High-Content (Perkin Elmer) cu o dimensiune a pasului z de 1 μm și un obiectiv de 20× cu imersie în apă (NA 0,16, 0,299 μm per pixel). Canale: DAPI (excitație 375 nm, emisie 435-480 nm), Atto 425 (excitație 425 nm, emisie 463-501 nm), opal 520 (excitație 488 nm, emisie 500-550 nm), opal 570 (excitație 561 nm, emisie 570-630 nm), opal 650 (excitație 640 nm, emisie 650-760 nm). Lamele de țesut fixate-congelate au fost imaginate cu ajutorul unui microscop confocal LSM710 (Zeiss) și a unui obiectiv cu imersie în ulei 40× (ulei 1,3, DIC III). Canale: DAPI (excitație 375 nm, emisie 435-480 nm), Alexa Fluor 488 (excitație 492 nm, emisie 517 nm), Atto 550 (excitație 560 nm, emisie 575 nm) și Atto 647 (excitație 649 nm, emisie 662 nm). Vizualizarea și îndepărtarea fundalului (raza mingii rulante) au fost realizate cu Fiji/ImageJ72. Pentru o mai bună vizualizare au fost utilizate pseudoculori.

Colorare cu haematoxilină și eozină

Eșantioanele de țesut au fost proaspăt congelate în izopentan (ThermoFisher) la -80 °C și încorporate în OCT (VWR). Secțiunile au fost tăiate la o grosime de 10 μm cu ajutorul unui microtometru, plasate pe lame SuperFrostPlus (VWR) și prelucrate ulterior în conformitate cu un protocol standard de colorare cu hematoxilină și eozină (Extended Data Fig. 12a).

Achiziționarea țesutului muscular scheletic

Eșantioanele de mușchi intercostal au fost obținute între a doua și a treia coastă pe partea stângă. Aceasta este de obicei din cel mai profund strat de mușchi (cel mai îndepărtat de piele). Probele au fost colectate direct în soluția de conservare la rece.

Insolarea nucleilor pentru mușchiul scheletic

Tesutul muscular a fost spălat în 1× PBS, curățat de orice depuneri vizibile de grăsime și tocat pentru a obține fragmente de aproximativ 1 mm3. Pentru fiecare eșantion, aproximativ 0,3 g de țesut tocat a fost omogenizat în 3 ml de tampon A (250 mM zaharoză, 10 mg ml-1 BSA, 5 mM MgCl2, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasIn, 1× inhibitor de protează) folosind setul de măcinare a țesuturilor Dounce (Merck) cu 50 de lovituri ale pisălogului liber (A). Omogenatul a fost filtrat printr-un filtru de celule de 100 μm (Corning), iar filtrul a fost spălat cu 1 ml și apoi cu 750 μl de tampon A. După adăugarea de Triton X-100 (concentrație finală de 0,5 %), amestecul a fost omogenizat în continuare cu 50 de lovituri ale pisălogului strâns (B). După filtrarea printr-un filtru de 40 μm, nucleii au fost centrifugați (3.000 g, 5 min, 4 °C), resuspendați în 1 ml de tampon B (320 mM zaharoză, 10 mg ml-1 BSA, 3 mM CaCl2, 2 mM acetat de magneziu, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1× inhibitor de protează, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasin) și purificat cu ajutorul unei soluții de gradient Percoll 27%. Amestecul Percoll a fost centrifugat la 20 000 g (15 min, 4 °C), iar peletul a fost resuspendat în 200 μl de tampon B, urmat de centrifugare (20 000 g, 3 min, 4 °C). După colorarea cu Trypan Blue, nucleii intacți au fost numărați cu ajutorul unui hemocitometru. Nucleele au fost profilate cu ajutorul unui Chromium Controller (10X Genomics) în conformitate cu protocolul producătorului.

Single-cell isolation for skeletal muscle

Tesutul muscular a fost spălat în 1× PBS, curățat de orice depunere vizibilă de grăsime și tocat fin. Apoi, 2 g de țesut mărunțit a fost transferat în tamponul de digestie 1 (750 U ml-1 de colagenază de tip 2 în 1× PBS) și incubat la 37 °C într-o baie de apă timp de 90 de minute. Țesutul parțial digerat a fost colectat prin centrifugare (650 g, 5 minute, 4 °C), iar granulele au fost resuspendate în tamponul de digestie 2 (100 U ml-1 colagenază de tip 2, 2 U ml-1 dispază în PBS). După 30 de minute de incubare la 37 °C într-o baie de apă, digestia a fost oprită prin adăugarea a 2% FBS. Celulele au fost filtrate printr-un filtru de nailon de 100 μm și unul de 40 μm (BD Falcon), colectate prin centrifugare (650 g, 4 °C, 3 min) și spălate cu 1× PBS, 2% FBS. Ulterior, pentru purificarea celulelor s-a utilizat un gradient Percoll 20% (15 000g, 4 °C, 20 min). Stratul care conținea celule a fost colectat, spălat în PBS cu 2% FBS, iar celulele viabile au fost numărate prin excludere cu Trypan Blue cu ajutorul unui hemocitometru. Nuclee au fost profilate cu ajutorul unui Chromium Controller (10X Genomics) în conformitate cu protocolul producătorului.

Tabloul cu resursele cheie ale metodelor se află în tabelul suplimentar 24.

Cartarea transcriptomului

După secvențiere, probele au fost demultiplexate și stocate ca fișiere CRAM. Fiecare eșantion a fost cartografiat la genomul uman de referință (GRCh38 v.3.0.0) furnizat de 10X Genomics și utilizând suita CellRanger (v.3.0.1) cu parametrii impliciți. Eșantioanele unicelulare au fost cartografiate în raport cu referința așa cum a fost furnizată. Eșantioanele cu un singur nucleu, referința pentru ARNm, a fost creată utilizând instrucțiunile 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references).

Procesarea datelor de numărare

După cartografiere, eșantioanele din fiecare sursă de date (nucleu unic, celulă unică și celulă CD45+) au fost grupate în obiecte AnnData individuale prin concatenarea raw_feature_bc_matrix_h5.h5 și adăugarea informațiilor corespunzătoare privind metadatele. Pentru fiecare obiect sursă de date, a fost calculată media identificatorilor moleculari unici (UMI) (n_counts) și a fost utilizată ca prag pentru picăturile goale.

Detecția dubletelor

După eliminarea picăturilor goale, am aplicat scrublet73 pentru a atribui un scor de dublet (scrublet_score) fiecărei celule. Aceste celule au fost grupate și vizualizate cu ajutorul metodei UMAP74. În plus, fiecare celulă a fost procesată pentru detectarea dubleților folosind o metodă de percolație pentru a permite o mai bună detectare a dubleților75.

Controlul calității și filtrarea celulelor

Care sursă de date a fost procesată și adnotată separat pentru a ține cont de diferențele de calitate specifice sursei. Aceste măsurători sunt incluse ca și covariate pentru prelucrarea ulterioară. Celulele totale și celulele CD45+ au fost filtrate pentru număr (500 < n_counts <15.000), gene (200 < n_genes), gene mitocondriale (percent_mito <20%), gene ribosomale (percent_ribo <20%) și scorul scrublet (scrublet_score <0,3). Nucleele unice au fost filtrate pentru numărători (500 < n_counts <15.000), gene (300 < n_genes <6.000), gene mitocondriale (percent_mito <5%), gene ribosomale (percent_ribo <5%) și scorul scrublet (scrublet_score <0,3). Aceleași praguri de filtrare au fost aplicate la setul de date privind mușchii scheletici.

Scanpy toolkit 1.576 in Python v.3.7 a fost utilizat pentru a efectua analize în aval, inclusiv normalizarea (normalize_per_cell: counts_per_cell_after = 10.000), transformarea logaritmică (log1p), detectarea genelor variabile (highly_variable_genes), regresia surselor nedorite de variație (regress_out: n_counts și percent_mito), scalarea caracteristicilor datelor (scale: max_value = 10) și PCA (pca: using highly variable genes), așa cum a fost descrisă anterior77.

Aliniere pe loturi folosind un autocodificator variațional profund

Am construit un manifold global prin alinierea tuturor surselor de date și a donatorilor din datele noastre. Acest lucru a fost realizat printr-o procedură în trei etape: (1) Fiecare sursă a fost analizată și adnotată separat, alinierea doar pentru donatori utilizând o etapă de regresie liniară în spațiul pericliților înainte de alinierea pe loturi cu bbknn78. Genele exprimate diferențial (DEG) au fost calculate folosind un test Wilcoxon rank sum cu ajustare Bonferroni-Hochberg, așa cum este implementat în cadrul Scanpy. (2) Pentru a adnota fiecare cluster, am utilizat o abordare integrativă prin căutarea celor mai semnificative DEG-uri (P < 1 × 10-5) cu un logFC >1 în bazele de date ToppFun79 și EnrichR80. Rezultatele semnificative privind căile, reglementarea transcripțională și procesele biologice au fost prioritizate pentru a adnota un anumit cluster. Fiecare compartiment celular a fost etichetat sub slotul adata.obs după gruparea stărilor celulare specifice sursei. (3) Toate sursele au fost combinate într-un singur obiect AnnData sub eticheta adata.obs. Loturile au fost aliniate cu ajutorul funcției batch_correction din autocodificatorul variațional scGen81. Mai întâi ne-am aliniat pentru adata.obs, folosind adata.obs ca ancoră. Apoi, ne-am aliniat pentru adata.obs, folosind adata.obs ca ancoră. Fiecare rundă de aliniere pe loturi a fost executată timp de 50 de epoci.

Manifoldurile pentru populațiile adipocitelor, vasculare și imune cardiace, precum și analiza mușchiului scheletic, au fost create folosind această metodă, iar acuratețea grupării a fost evaluată cu SCCAF82 (Extended Data Fig. 12d).

DEGs

Pentru a ajuta la adnotarea subpopulațiilor din fiecare compartiment celular, am calculat DEGs utilizând testul Wilcoxon rank sum, așa cum este implementat în fluxul de lucru scanpy și recomandat de studii recente de benchmarking83. O genă a fost considerată ca fiind diferențiat exprimată dacă are o schimbare fold transformată în log2 > 1 și un P < 1 × 10-5, cu excepția cazului în care se specifică altfel în secțiunea de analiză.

Interacțiuni celulă-celulă

Matricele de expresie ale populațiilor studiate au fost exportate din AnnData, împreună cu un tabel de metadate care conținea codurile de bare de celule ca indici. Apoi am rulat CellPhoneDB după cum urmează: cellphonedb method statistical_analysis meta.tsv counts.tsv-counts-data = gene_name-threads = 60. Predicțiile brute CellPhoneDB au fost filtrate prin eliminarea acelor interacțiuni cu un P > 1,0 × 10-5. Perechile semnificative au fost apoi trimise pentru analiza de îmbogățire a setului de gene în ReactomeDB, enrichR și ToppFun pentru clasificarea funcțională. Celulele vasculare au fost subeșantionate aleatoriu la 39.000 de celule înainte de analiză, iar grupul de reparații cardiace (cardiomiocite atriale și ventriculare, FB și celule imune) a fost subeșantionat aleatoriu la 69.295 de celule înainte de analiză.

Vizualizarea expresiei genice pe datele Visium de la 10X Genomics

Am procesat datele Visium ale miocardului ventricular stâng disponibile public de la 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.0.0/V1_Human_Heart) folosind Scanpy v.1.5 adaptat pentru analiza datelor Visium de la 10X Genomics (https://scanpy-tutorials.readthedocs.io/en/latest/spatial/basic-analysis.html). Pe scurt, au fost eliminate spoturile cu mai puțin de 500 UMI sau mai mult de 20.000 UMI și mai puțin de 200 de gene. Datele au fost transformate logaritmic și normalizate înainte de trasare.

Estimarea vitezei ARN

Pentru a calcula viteza ARN a celulelor unice și a celulelor unice îmbogățite cu CD45+, am folosit fișierul BAM de ieșire CellRanger și fișierul GENCODE v33 GTF (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz) împreună cu velocyto84 CLI v.0.17.17 pentru a genera un fișier loom care conține cuantificarea ARN-ului îmbinat și neîmpletit. Apoi, am construit un manifold, am grupat celulele și am vizualizat vitezele ARN folosind scVelo85.

Subpopulation analyses of atrial and ventricular cardiomyocytes, FBs and neuronal cells

Toate codurile de bare etichetate în obiectul global ca fiind cardiomiocite, fibroblaste și celule neuronale au fost selectate pentru analize suplimentare ale subpopulațiilor. Criteriile suplimentare de filtrare specifice populației celulare au fost aplicate nucleelor, după cum urmează: număr de cardiomiocite (n_counts <12.500), gene (n_genes <4.000), gene mitocondriale (percent_mito <1%), gene ribosomale (percent_ribo <1%) și scorul scrublet (scrublet_score <0.25); gene mitocondriale FB (procente_mito <1%), gene ribosomale (procente_ribo <1%); gene ale celulelor neuronale (n_genes <4000), gene mitocondriale (procente_mito <1%), gene ribosomale (procente_ribo <1%). Celulele totale și CD45+ au fost excluse din seturile de date privind cardiomiocitele atriale și ventriculare și nu au contribuit la analiza subpopulațiilor. Nu s-a aplicat nicio altă filtrare a FB sau a celulelor totale și a celulelor CD45+ neuronale. Cardiomiocitele și FB-urile au fost apoi împărțite în continuare în două grupări pe baza regiunii de origine: (1) atriul stâng și drept, și (2) ventriculul stâng și drept, apexul și septul interventricular.

Efectele donatorilor au fost aliniate așa cum este descris în etapa (1) de mai sus. Pentru celulele FB și neuronale, sursele au fost aliniate așa cum este descris în etapa (3) de mai sus. Gruparea Leiden și vizualizarea UMAP au fost efectuate pentru identificarea subpopulațiilor și vizualizarea86. Genele exprimate diferențiat au fost calculate cu ajutorul testului Wilcoxon rank sum. Genele au fost clasificate în funcție de scor.

Compararea între țesuturile populațiilor imune cardiace cu populațiile imune din mușchiul scheletic, rinichi și sânge

Am colectat date transcriptomice unicelulare pentru rinichi adulți din ref. 99 (https://www.kidneycellatlas.org/), și am subansamblat toate celulele imune raportate în studiul lor. Pentru SKM am selectat celulele imune adnotate din colecția fuzionată. Pentru sângele uman, am utilizat setul de date de 10.000 de celule PBMC unice, disponibil public, furnizat de 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/3.0.0/pbmc_10k_v3). Așa cum am descris anterior87, am antrenat un model de regresie logistică pe celulele imune cardiace folosind 80 % din datele de expresie și am testat acuratețea acestuia pe restul de 20 % pentru a produce un model cu o acuratețe de 0,6862 (Date extinse Fig. 8f, Tabelul suplimentar 16). Am aplicat apoi acest model pentru a prezice populațiile imune cardiace analoge în rinichiul adult, SKM și PBMC. Predicțiile cu o probabilitate mai mică de 0,8 au fost excluse din analizele comparative din aval.

Analiză de îmbogățire a ontologiei genelor

Pentru populația de cardiomiocite ventriculare, am utilizat pachetul R gProfileR (https://cran.r-project.org/web/packages/gProfileR/index.html) cu lista de gene cu punctaj clasificat de vCM4 ca intrare și setul de gene exprimate în cardiomiocitele ventriculare ca fundal (acele gene care au un număr de UMI >1). Pentru a efectua analiza Gene Ontology asupra celulelor vasculare, cele mai importante 500 de DEG-uri semnificative (P < 1 × 10-5) cu o schimbare fold transformată logaritmic > 1 au fost căutate în baza de date de procese biologice Gene Ontology folosind ToppFun79 (tabelul suplimentar 25). Primii cinci termeni îmbogățiți semnificativ (q < 0,05) pentru fiecare subpopulație au fost selectați și reprezentați pe o hartă termică. Pentru a efectua analiza căilor de acces pe adipocite, cele mai importante 500 de DEG-uri semnificative (P < 1 × 10-5) cu o schimbare de pliere log-transformată > 0,5 au fost căutate în bazele de date de căi de acces ToppFun79 (Tabelul suplimentar 26). Primele cinci căi îmbogățite în mod semnificativ (q < 0,05) pentru fiecare subpopulație au fost selectate și reprezentate pe o hartă termică.

Gene set score

Utilizăm funcția score_genes, așa cum este implementată în scanpy, pentru a calcula îmbogățirea genelor implicate în calea Oncostatin M. O listă de gene a fost colectată în urma cercetării literaturii88,89. Pentru îmbogățirea setului de gene, au fost luate în considerare doar genele foarte bine exprimate pentru a reduce zgomotul (mai mult de 500 de UMI-uri în toate celulele). Aceeași analiză a fost efectuată pentru compararea celulelor imune cardiace din studiul nostru cu observațiile studiilor anterioare privind macrofagele rezidente cardiace51, macrofagele de remodelare a țesuturilor de șoarece45 și cele de origine a liniei sacului gălbenușului90.

Statistică și reproductibilitate

Toate analizele au fost efectuate utilizând software-ul R, v.3.6.1. Testele t ale lui Student au fost utilizate pentru a compara distribuțiile tipurilor de celule la fiecare situs. P < 0,05 a fost considerat semnificativ din punct de vedere statistic. Modelele de regresie liniară (corelații) au fost obținute cu ajutorul funcției R linear model (lm), care estimează probabilitatea statistică (valoarea P) a unei relații liniare. Corecția Bonferroni a fost aplicată pentru teste multiple.

Micrografiile RNAscope descrise în figuri sunt reprezentative. Micrografiile din figurile 2g, 3c, h și datele extinse din fig. 3c (HAMP), datele extinse din fig. 3e (CNN1), datele extinse din fig. 4g, m, 6f au fost repetate cu rezultate similare în două secțiuni individuale de țesut. Micrografiile din figurile 2h, 3f și Extended Data Fig. 3c (CNN1), Extended Data Fig. 3e (PCDH7), Extended Data Figs. 6e, h, 9d au fost repetate cu rezultate similare în trei secțiuni individuale de țesut. Micrografiile din figurile 1e, 2d, 3e și Figurile cu date extinse 1f, 3c (FHL1) și Fig. 6d cu date extinse au fost repetate cu rezultate similare în patru secțiuni individuale de țesut. Micrografiile din Fig. 2c și Fig. 3c (PRELID2), Fig. 10e, 12a (Extended Data Figs. 10e, 12a) au fost repetate cu rezultate similare în șase sau mai multe secțiuni individuale de țesut. Controalele pozitive și negative au fost efectuate o dată pentru fiecare probă utilizată.

Analiză de îmbogățire GWAS

Am descărcat statisticile sumare GWAS din cvdi larg, catalogul EBI GWAS și atlasul GWAS. Am selectat trăsături cu GWAS bine potențate (n > 5.000 și număr de loci semnificativi >10). Seturile de date GWAS sunt rezumate în tabelul suplimentar 27. Datele de expresie genetică ale genelor codificatoare de proteine au fost cartografiate pe ID-uri de gene Entrez și aceste adnotări de gene au fost utilizate pe ansamblul genomului uman hg19/37. Am utilizat numai date de expresie genetică din nuclee. Am implementat analiza descrisă anterior64 în python și în R. Numărătorile cu transformare logaritmică (plus un pseudo-numărător) au fost utilizate pentru a calcula profilurile medii de expresie specifice tipului de celule. Am efectuat analize magmatice individuale pentru fiecare tip de celulă, condiționând întotdeauna de covariate implicite la nivel de genă (de exemplu, lungimea genei) și expresia medie a genelor în toate celulele. Ulterior, am aplicat metoda Benjamini-Hochberg și am selectat asocierile de trăsături de tip celular cu FDR < 10%. Aceste perechi au fost apoi supuse unei analize condiționate, așa cum a fost descrisă anterior64 , pentru a defini perechile de asocieri „independente”, „explicate în comun” și „parțial explicate în comun” (Tabelul suplimentar 28).

Distribuțiile celulelor dispersate și ale nucleelor izolate

Procedurile diferite de obținere a nucleelor izolate și a celulelor dispersate au dus la distribuții semnificativ diferite ale tipurilor de celule (Tabelul suplimentar 29, Fig. 2 din datele extinse). În special, 30,1 % și 49,2 % din nucleii izolați proveneau din cardiomiocite atriale și ventriculare din regiunile atriale și ventriculare, în timp ce aceste celule au fost excluse în cea mai mare parte din preparatele de celule izolate și selectate CD45 (Tabelul suplimentar 2).

Excluzând cardiomiocitele, distribuția tipurilor de celule identificate din nuclei izolați și celule dispersate a rămas distinctă (Tabelul suplimentar 30). Deși 59,0% din celulele dispersate erau CE, doar 15,7% din nuclei proveneau din CE. În schimb, 64,2 % din nuclee proveneau din FB (31,2 %) și pericite (33,0 %), în timp ce doar 17,1 % din celulele dispersate erau FB (2,3 %) și pericite (14,8 %). Aceste diferențe pot reflecta sensibilitatea nucleelor CE la procedurile de izolare sau rezistența pericitelor și FB-urilor la digestia enzimatică celulară.

În ciuda diferențelor în distribuția celulară între nucleele izolate și celulele dispersate, profilurile de expresie genică ale liniilor celulare au fost corelate în mod rezonabil (r > 0,4 pentru fiecare tip de celule). Pentru a aborda concordanța genelor captate de celule și nuclee, am comparat expresia markerilor principali ai tipurilor de celule din Fig. 1c în cele trei surse (Date extinse Fig. 1c). Deoarece nucleii nu au ARN citoplasmatic, expresia anumitor gene, în special a genelor imune NKG7 și C1QA, a fost mai mică în nuclei decât în celule. Cu toate acestea, tendința generală în ceea ce privește genele marker a fost consecventă în cele trei surse, iar aceleași gene au distins tipurile individuale de celule, indiferent de sursă.

Analiză suplimentară a celulelor vasculare

Pc3_str conținea o contribuție similară de celule și nuclee și a avut un scor scrublet sub pragul riguros utilizat; cu toate acestea, numărul mediu de gene și numărul de celule din acest cluster a fost mai mare decât media. Astfel, în ciuda filtrării riguroase a calității noastre, nu putem exclude posibilitatea ca în acest cluster să existe dublete. EC10_CMC-like și PC4_CMC-like co-exprimă genele CE sau ale pericitului cu markerii cardiomiocitelor și sunt necesare studii suplimentare pentru a înțelege dacă acestea reprezintă stări celulare necunoscute anterior sau dublete.

Observațiile SMC arteriale și venoase sunt susținute de studii anterioare, care prevăd că SMC arteriale sunt mai contractile, iar SMC venoase sunt mai puțin diferențiate91.

EC3_cap se îmbogățesc pentru transcripții care codifică componente ale AP1 (JUN și FOS), care mediază multiple decizii privind soarta CE, inclusiv răspunsul la VEGF, semnale inflamatorii și de stres, și ATF3, o genă de răspuns adaptiv indusă de diverse semnale92,93,94.

Caracterizarea mușchilor scheletici

Am colectat probe de mușchi scheletici intercostali de la cinci persoane sănătoase, inclusiv de la un donator cu țesut cardiac corespondent, și am profilat transcriptomul a 35.665 de celule unice și 39.597 de nuclei unici. În mod analog cu inima, combinația de celule și nuclee ne-a permis să capturăm și să rezolvăm principalele linii celulare, inclusiv cardiomiocite, fibroblaste, celule endoteliale, celule musculare netede, pericite, celule imune mieloide și limfoide și celule satelit (Extended Data Fig. 11a, b, Supplementary Table 31).

Analiza suplimentară a celulelor vasculare ale mușchiului scheletic a identificat zece populații distincte. Celulele endoteliale au prezentat cinci grupuri separate pe baza paturilor lor vasculare respective, cu semnături similare cu cele pe care le observăm în inimă. EC_cap exprimă VWF și RGCC. EC_ven venoase exprimă ACKR1 și PLVAP, în timp ce EC_art arteriale arată SEMA3G și HEY1, în concordanță cu datele noastre despre inimă (Extended Data Fig. 11c, d, Supplementary Table 32).

Distribuțiile generale ale populațiilor de celule vasculare și stromale din mușchiul scheletic și cardiac au fost similare, inclusiv caracteristicile arteriale și venoase ale EC; cu toate acestea; mușchiul scheletic conținea un singur cluster SMC, potențial legat de dimensiunea mai mică a setului de date. În mușchiul scheletic, interacțiunile celulă-celulă prezise ale EC_art și SMC au inclus NOTCH1/4-JAG1, precum și JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH3, dar nu JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH2, deduse în inimă (Extended Data Fig. 11e, f, Extended Data Fig. 11e, f, Supplementary Table 33).

Celule imune cardiace

Utilizând modelul de regresie logistică, nu am identificat niciun corespondent al monocitelor IL17RA+ cardiace în SKM sau rinichi, posibil din cauza dimensiunii reduse a acestei populații.

Celulele T naive (CD4+T_naive) identificate au exprimat CCR7 și SELL, ceea ce indică natura lor naivă și rezidentă tisulară95. Celulele T cu memorie (CD8+T_tem) au exprimat BACH2, STAT4 și IL7R, asociate cu memoria imună pe termen lung96,97. Am caracterizat în continuare celulele limfoide cu ajutorul scNym98 și l-am antrenat cu ajutorul datelor publicate99,100. Modelul rezultat a fost aplicat celulelor noastre imune cardiace, iar acele celule, cu un scor prezis mai mare de 0,8, au fost considerate a fi candidate probabile pentru re-anotație. Utilizând această abordare, am identificat candidați pentru celulele B plasmatice (109), celulele dendritice (645), celulele limfoide înnăscute (89), celulele T MAIT (219), celulele T helper (80), celulele T reglatoare (11), celulele T cu memorie centrală (103), celulele T γδ (30) și celulele dendritice plasmocitoide (27). Aceste adnotări pot fi găsite în adnotările obiectului imunitar cardiac sub eticheta „scNym” la www.heartcellatlas.org.

Rezumat de raportare

Informații suplimentare privind designul cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare Nature Research, legat de acest articol.

.