Resultados e Discussão
Estabilidade do Genoma VARV e Análise Filogenética.
A disponibilidade de seqüências genômicas de uma coleção de isolados VARV com ampla distribuição geográfica (Fig. 1) foi utilizada para o estudo evolutivo de VARV (4). VARV, um membro do gênero Orthopoxvirus, contém um único genoma de DNA linear de dupla cadeia de 186 kb que codifica a maioria das enzimas para sua propagação (5). Os isolados VARV estudados demonstraram uma baixa taxa de mutação porque os isolados epidemiologicamente ligados mostraram poucas ou nenhumas mudanças de seqüência em amostras com tempos de coleta de até 1 ano de intervalo. Esta baixa taxa de mutação pode ser claramente observada em nossas amostras geneticamente idênticas de Bangladesh coletadas entre 1974 e 1975. Estas amostras representam certamente longas cadeias de transmissão complexas de uma das regiões mais densamente povoadas do mundo, mas têm sequências nucleotídicas idênticas ou quase idênticas. O vírus da varíola de macaco Orthopoxvirus relacionado mostra similarmente mudanças de nucleotídeos isolados de três hospedeiros diferentes em um surto recente nos Estados Unidos (6). Dentro e entre espécies de orthopoxvirus, os genomas possuem identidades de nucleotídeos de >99,6% entre isolados VARV e 98% entre VARV e taxas congêneres como o vírus taterapox (TATV) (4) (África Ocidental) e o vírus camelpox (CMLV) (7) (Ásia Central) (Tabela 1), duas espécies com a sequência mais alta similar ao VARV (4). O grande tamanho e a lenta taxa de substituição de nucleotídeos permitem que o DNA genômico VARV retenha mutações filogenicamente informativas enquanto diminui a incidência de mutações homoplásicas (ou seja, menos inversões de caracteres). A diversidade de 47 genomas VARV recentemente sequenciados foi largamente associada com a origem geográfica dos isolados (ref. 4 e este estudo), e as mutações tiveram uma associação mínima com a variação temporal entre os isolados. Estas observações demonstram que não houve uma única estirpe pandêmica ( Texto SI , Nota 1), mas sim que os clades genéticos destas análises são representativos de antigas e talvez antigas estirpes endêmicas locais.
Hipóteses da origem da VARV. Evento 0, A alta similaridade de VARV com CMLV e TATV seqüências de genoma sugere que TATV e CMLV compartilham um ancestral comum mais recente com VARV do que com outras espécies conhecidas de Orthopoxvirus. Evento 1, hipótese A: Um VARV ancestral divergiu em dois clades primários (P-I e P-II) e evoluiu independentemente no Velho Mundo e no Novo Mundo, seguindo seus hospedeiros humanos. Evento 1, hipótese B: A divergência de P-I/P-II na África. Evento 2, hipóteses A e B: O longo ramo único e a radiação subsequente de P-I sugerem que a VARV ancestral de P-I provavelmente teve origem no Nordeste da Ásia e que as endemias de varíola de P-I começaram a se espalhar para o Leste Asiático, Oriente Médio e Índia à medida que as populações locais se tornaram suficientemente grandes. Evento 2a, A diversificação e migração do P-I por toda a Ásia. Evento 2b, a exploração ocidental trouxe VARV major para a África do Sul a partir do subcontinente indiano, que depois se espalhou para o norte para a África Central e para o Corno de África (Península da Somália). Eventos 3 e 4, hipótese A: A diversificação do P-II no Novo Mundo seguida da sua reintrodução em África; hipótese B: A diversificação do P-II na África, seguida da introdução posterior de uma subclasse no Novo Mundo.
Se a radiação P-I representa a história endémica da varíola no Velho Mundo, explica o enigma histórico relativo à ausência de uma descrição da varíola na literatura das antigas civilizações grega e romana (1). É provável que as epidemias de varíola nesta região tenham ocorrido numa época posterior às da China e da Índia antigas. A “peste de Atenas” em 430 a.C. descrita por Tucídides, uma vez considerada como varíola (3), contradiria esta teoria, mas foi recentemente determinada como sendo febre tifóide (25). Durante o reinado de Ramsés V, o Egito estava em uma guerra civil e foi atacado por inimigos do norte (3); se a erupção pustular de Ramsés V era de varíola, poderia representar um surto de varíola de casos importados por causa da guerra e não de doença endêmica regional. Esta hipótese é suportada pelo fato de que apenas três múmias naquele período tiveram lesões semelhantes (2).
Diversificação de Alastrim menor.
A história da varíola/VARV baseada na topologia mostra que a divergência entre a varíola alastrim menor e a variola da África Ocidental começou há pelo menos 800 anos (Tabela 2 e SI Tabela 4), predando a hipótese anterior de que esta divergência coincide com o início do tráfico de escravos. Sob a hipótese de origem mais antiga, esta divergência poderia ter ocorrido após um evento de especiação no Novo Mundo (baseado na calibração dos primeiros registros históricos da varíola; Fig. 3 A) ou na África Ocidental (baseado na calibração dos registros históricos da varíola sul-africana; Fig. 3 B). Estes cenários sugerem que existiam isolados de varíola menor/alastrim não identificados que existiam tanto em África como no Novo Mundo muito antes da descoberta do alastrim menor (P-II); assim, este táxon tem uma história mais longa do que a descrita.
Embora a bem documentada importação de VARV para as Américas tenha tido um efeito devastador em muitas das populações nativas (2), os registros de rápida disseminação de doenças com grande mortalidade podem, em parte, ser atribuídos ao efeito combinado da alta densidade populacional, falta de cuidados básicos para as vítimas, e potenciais coinfecções com outras doenças do Velho Mundo (26, 27). Historicamente, há poucos registros de varíola na África Ocidental, e Henige (28) argumentou que o primeiro grande surto de varíola VARV no Novo Mundo não teve origem na África Ocidental, o que refutaria a hipótese de uma história inicial de varíola na África Ocidental. É possível que após uma introdução antiga, o alastrim tenha evoluído independentemente em regiões isoladas dentro da grande área geográfica do Novo Mundo. De fato, o estudo de Phelan mostrou que as populações nativas das Terras Altas do Equador não diminuíram durante o domínio espanhol inicial (atribuído a ter introduzido VARV major no Novo Mundo) (29), sugerindo que essas populações poderiam ter sido mais resistentes à varíola, talvez por contato prévio com a alastrim. Em Trinidad, um surto leve de varíola em 1902 foi documentado como tendo tido origem nesta região (30). Se esta diversificação tivesse ocorrido no Novo Mundo, então o evento primário de isolamento provavelmente teria resultado do movimento de um VARV ancestral com humanos primitivos para aquela região (Fig. 4A). A ausência de assinaturas SNP sugestiva de mistura entre P-I e P-II (SI Figs. 6 e 7), as características clínicas consistentes e significativamente diferentes do alastrim do tradicional VARV maior do P-I (31), poderia ser explicada por uma separação geográfica tão significativa.
Se a divisão do P-I/P-II ocorresse dentro do Velho Mundo, o P-II provavelmente teria tido origem na África Ocidental. As duas subclades de P-II teriam então divergido ≈800-1,100 YBP (Tabela 2 e SI Tabela 4) no continente africano. As distribuições geográficas destes eventos são difíceis de determinar devido a uma falta de história escrita nestas regiões. No entanto, a presença e diversificação de outros Orthopoxviruses estreitamente relacionados, tais como a varíola macaco e o TATV, poderiam apoiar uma origem africana para os VARV ancestrais. Se o isolamento e a diversificação do P-II ocorreu em África, então, com base na nossa filogenia, existe um representante africano não descrito da subclade P-II, que foi introduzido no Novo Mundo talvez centenas de anos após o evento de diversificação, possivelmente durante o tempo do comércio de escravos entre países do Velho e do Novo Mundo (Fig. 3 B).
Um entendimento inadequado da história destas culturas e os sintomas clínicos relativamente mais leves (com respeito à variola major) contribuem para a ausência de um registro histórico mais extenso de doença(s) da varíola, tanto no Novo Mundo como na África Subsaariana. As densidades históricas da população humana em ambas as regiões eram inferiores às das regiões com varíola major endêmica. Em casos de doença mais branda, os indivíduos teriam sido mais móveis quando infecciosos e teriam tido um maior número de contactos, perpetuando assim a propagação da doença. Em apoio a esta hipótese, os surtos de varíola leve na Somália persistiram por longos períodos entre as pequenas bandas nômades e mostraram um padrão de transmissão significativamente diferente em comparação com o de VARV major (2). Embora não se saiba se a prática da variolação/inoculação foi usada pelos povos indígenas da África ou das Américas, a longevidade do VARV dentro das crostas convalescentes (até uma década) (32-34) forneceria outro mecanismo para a introdução repetida de uma estirpe de varíola dentro de uma comunidade geográfica, seja por contato inadvertido com materiais da crostas ou diretamente através de práticas de variolação.
Origina de VARV.
Possíveis pistas sobre a adaptação de VARV a humanos podem ser encontradas na estreita relação entre VARV e TATV/CMLV (4). A TATV está associada a um roedor terrestre nativo da África Ocidental (35). Nossas análises coalescentes indicam que a divergência entre VARV e TATV ocorreu de 16.000 YBP (Tabela 2 e SI Dataset 4, baseado nos registros históricos de varíola da África do Sul) para 68.000 YBP (Tabela 2 e SI Dataset 3, baseado na história mais antiga de varíola registrada na Ásia Oriental). Assim, assim como os ortoprovírus zoonóticos com reservatórios de roedores (6, 36, 37), os VARV podem ter evoluído de um patógeno enzótico de roedores africanos e subseqüentemente se espalharam para fora da África.
As seqüências genômicas de isolados de VARV selecionados para este estudo foram retirados do repositório do Centro Colaborador da Organização Mundial da Saúde e, embora apresentem um baixo nível de divergência de seqüências, são representativos da maior diversidade geográfica e temporal dentro da coleção. A filogenia derivada do cSNP destes isolados produz uma topologia consistente com padrões históricos migratórios humanos, expansão populacional e epidemias documentadas de varíola. A topologia descrita suporta a hipótese (Fig. 3) de que dois clades de variola divergiram de um vírus ancestral e subsequentemente evoluíram em populações humanas geograficamente discretas. Embora a razão para as diferentes patogenias humanas de alastrim e VARV major não seja clara, a estrutura genética de alastrim menor e sua topologia com os outros isolados VARV adicionam peças críticas ao quebra-cabeças evolutivo da varíola. Esta filogenia proposta de VARV estende o tempo evolutivo da varíola em relação às teorias anteriores.