Imunopatologia de patógenos altamente virulentos: insights do vírus Ebola

Vírus Ebola é um vírus RNA de cadeia negativa envolvida da família Filoviridae, um grupo de vírus capaz de induzir uma grave síndrome de febre hemorrágica em humanos e primatas não humanos. O vírus foi reconhecido pela primeira vez em 1976 durante um surto no vale do rio Ebola, no Zaire (actual República Democrática do Congo), África. Um segundo surto causado por um vírus distinto mas relacionado ocorreu no Sudão mais tarde, no mesmo ano1,2. Desde a sua descoberta na África Central, vários surtos repetiram-se nos últimos 30 anos, incluindo um actual surto confirmado (11 de Setembro de 2007) na República Democrática do Congo (http://www.who.int/csr/don/2007_09_11/en/index.html). Embora o reservatório de vírus na natureza e a gama de hospedeiros intermediários não seja totalmente compreendido, estudos recentes descobriram que morcegos frugívoros podem suportar a replicação do vírus Ebola, indicando que estes animais podem estar envolvidos no ciclo de vida do vírus3. Contudo, o hospedeiro natural do vírus ébola na ausência de surtos ativos, juntamente com a importante questão de como ele é transmitido entre várias espécies, representa um assunto contínuo de investigação.

Infecções humanas geralmente ocorrem após contato direto com o vírus em pessoas mortas ou infectadas ou na vida selvagem, com posterior transmissão de pessoa para pessoa. Os filovírus entram no corpo através de superfícies mucosas ou abrasões cutâneas ou através do uso de agulhas contaminadas4 (Fig. 1a). O início da doença induzida pelo vírus Ebola é repentino, com um período de incubação de 4 a 10 dias. Os pacientes apresentam inicialmente sintomas não específicos semelhantes aos da gripe, como febre, calafrios, mal-estar, dores musculares e dores de cabeça. Podem seguir-se dores abdominais, náuseas e vómitos e também pode estar presente tosse, dor de garganta ou diarreia. Uma erupção cutânea aparece frequentemente por volta do quinto dia e é uma característica da infecção por filovírus. As manifestações sistêmicas, gastrointestinais, respiratórias, vasculares e neurológicas resultam de extensa replicação viral, sendo observada necrose em muitos órgãos, incluindo o fígado, baço, rins e gônadas5. O estágio terminal da doença é caracterizado por distúrbios de coagulação, tais como coagulação intravascular disseminada, problemas de distribuição de fluidos, hipotensão e hemorragia devido à inflamação e comprometimento do fígado, ruptura tecidual e quebra da função da barreira endotelial que leva ao aumento da permeabilidade vascular. Em casos fatais, a morte ocorre tipicamente entre 7 e 16 dias após a infecção, o resultado de falência de múltiplos órgãos e o início de uma síndrome que se assemelha a um choque séptico grave6. Não existem atualmente medicamentos antivirais para tratar a infecção e as taxas de mortalidade das espécies mais virulentas do Zaire e Sudão do vírus variam de 40-90%7,

Resposta imune do hospedeiro à infecção fatal pelo Ebola

A replicação viral não controlada do vírus Ebola é central para sua patogênese, tanto por causa de seus efeitos citopáticos quanto por induzir uma desregulação proeminente da resposta imune do hospedeiro. O comprometimento do sistema imunológico virtualmente induzido ocorre através de uma variedade de mecanismos. Estudos em primatas não humanos, bem como em cobaias, levantam a possibilidade de que monócitos, macrófagos e células dendríticas sejam locais precoces e preferidos de replicação viral8,9, embora continue sendo possível que o vírus esteja presente nessas células através da ligação a receptores de lectina, ao invés de replicação ativa in vivo. Tem sido sugerido que essas células atuem como veículos para o transporte do vírus através dos linfáticos10. Segue-se uma maior replicação viral, seguida de disseminação sistêmica para outros órgãos e tecidos (Fig. 1b). Embora o vírus seja observado no sistema reticuloendotelial, pouca inflamação é observada dentro dos linfáticos ou nos tecidos infectados durante o curso da infecção.

Infecção de monócitos e macrófagos leva à liberação de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, incluindo fator de necrose tumoral, interleucina-1β, proteína inflamatória de macrófagos-1α e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio11,12. A expressão desses mediadores é susceptível de atrair mais monócitos e macrófagos para os locais de infecção, podendo também atrair neutrófilos. Embora dados recentes sugiram que eles não estão infectados produtivamente, os neutrófilos humanos tratados com filovírus in vitro mostram rápida ativação do receptor desencadeador expresso em células mielóides-1 (TREM-1)13; isso resulta na liberação de outras citocinas inflamatórias e quimiocinas que contribuem para vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular. Além disso, os monócitos e macrófagos infectados expressam o fator de superfície celular, que pode estar envolvido no desenvolvimento de coagulopatias14. Após infecção produtiva, os macrófagos sofrem lise celular e apoptose em grande número15; assim, os monócitos e macrófagos ativados não parecem impedir a disseminação viral. Pelo contrário, eles podem contribuir para a disseminação, apoiando a replicação viral ou transportando vírus ligados a proteínas de ligação da lectina de superfície celular dentro do sistema linfático. E como os neutrófilos, monócitos e macrófagos também podem secretar fatores solúveis que exacerbam as manifestações patogênicas da doença13,

Como os monócitos e macrófagos, células dendríticas imaturas (DCs) são “alvos” do vírus Ebola, seja por meio da fixação de partículas virais através de interações com a lectina tipo C DC-SIGN ou por meio de infecção através da interação com outros receptores de superfície celular DC-expressos (Fig. 1c). As células dendríticas estão entre as células mais eficazes do sistema imunológico que apresentam antígenos, e secretam interleucinas e citocinas críticas que fornecem uma ligação crítica entre respostas imunes inatas e adaptativas a muitos patógenos; as DC infectadas com o vírus Ebola estão severamente comprometidas nestas funções críticas. As CD mielóides humanas infectadas com vírus vivos in vitro, por exemplo, não conseguem secretar o perfil normal das citocinas pró-inflamatórias e das moléculas costimulatórias. Essas células não se tornam maduras ou ativadas e são incapazes de upregular moléculas do complexo de histocompatibilidade maior (MHC) e, assim, estimular as células T16,17. Em contraste, o tratamento com partículas não infecciosas semelhantes ao vírus Ebola (VLPs) ativa as DCs e estimula uma resposta inflamatória robusta18, um efeito dependente do domínio mucinoso da glicoproteína do envelope19. A inibição da função DC com vírus vivo ou inativado, mas não com VLPs, indica que a supressão da função e maturação da DC é provavelmente devida à presença de proteínas virais ou material genômico não presente nos VLPs. Estudos adicionais são necessários para esclarecer os efeitos prejudiciais da infecção pelo vírus Ebola em outras subpopulações de CD, em particular nas CD plasmocitóides, que são importantes nas respostas de interferon antivírico. As consequências das CD não funcionais incluem uma diminuição da capacidade de estimular respostas imunes humorais ou mediadas por células, o que pode contribuir para a falta de controle da replicação viral.

Um determinante principal do efeito inibitório na função imunológica inata é a resistência do vírus Ebola aos efeitos antivirais do interferon, que provavelmente se deve à interrupção das vias críticas de resposta do interferon pelo próprio vírus20,21,22; a produção de interferon é bloqueada em macrófagos, células mononucleares do sangue periférico e CDs pela infecção pelo vírus Ebola in vitro e in vivo16,23. Além disso, a expressão de genes estimulados por interferon, importantes na resposta ao interferon tipo I, é reduzida nas células infectadas pelo vírus Ebola20,22,24. A resposta do interferão também se mostrou muito importante para o resultado da doença em camundongos. Os ratos imunocompetentes são resistentes à infecção pelo vírus Ebola, mas os ratos que não possuem o receptor interferon-α/β ou o transdutor de sinal proteico e activador-1 (STAT1) ou que são tratados com anticorpos contra o interferão tornam-se susceptíveis à doença25, destacando o papel crítico do interferão na protecção das células não infectadas. Foram identificados vários mecanismos de resistência mediada pelo vírus Ebola à resposta do interferão. Como alguns outros vírus, o Ebola codifica proteínas virais específicas que antagonizam a resposta do interferão. Duas proteínas codificadas viralmente, VP24 e VP35, demonstraram interferir com a indução da resposta de interferão26,27,28. O acúmulo nuclear de STAT1 é interrompido pela VP24, o que leva a um bloqueio na sinalização do interferon tipo I e torna as células infectadas insensíveis a essa resposta antiviral27. O Ebola VP35 bloqueia a atividade do fator regulador do interferon 3 (IRF-3), diminuindo assim as respostas ao interferon26,28. Mais recentemente, a VP35 demonstrou neutralizar a atividade da proteína quinase dependente do RNA (PKR)29. Em combinação, estes estudos sugerem que a inibição da via do interferão induzida pelo vírus não só diminui a transcrição do gene estimulado pelo interferão para prevenir um estado de resposta antiviral, mas também contribui para diminuir o número de DC mielóide maduros e ativados, o que por sua vez dificulta a ativação da resposta imune adaptativa.

Surprprendentemente, os pacientes que sucumbem à infecção pelo vírus Ebola mostram poucas evidências de uma resposta imune adaptativa ativada. A imunidade adaptativa está severamente comprometida não só devido à falta de CD funcionais e outras células importantes que apresentam antígenos, mas também porque os linfócitos sofrem apoptose maciça em humanos infectados e primatas não humanos15,30,31. Embora os linfócitos não sejam alvos do vírus, números substanciais – com exceção das células B – sofrem apoptose durante a doença32; como resultado, o número de células T CD4+ e CD8+ é substancialmente reduzido nas infecções fatais por primatas humanos e não-humanos antes da morte30,31,33. A apoptose linfocitária também é uma manifestação comum de outras febres hemorrágicas virais e é freqüentemente observada durante o choque séptico34,

Estudos com linfócitos in vitro indicam que várias moléculas envolvidas no desencadeamento da apoptose estão presentes nessas populações celulares, incluindo TRAIL e Fas-FasL15. Entretanto, os mecanismos responsáveis por esta apoptose “de espectadores” ainda estão sob investigação. Pode ser que mediadores inflamatórios e outros fatores, como o óxido nítrico (NO) do fator pró-apoptótico solúvel secretado por macrófagos infectados, sejam capazes de induzir a apoptose linfocitária observada. Alternativamente, o comprometimento da função DC e um estado imunossupressor geral podem contribuir para o fenômeno31. Outra possibilidade é que a morte celular seja activamente desencadeada por interacções directas entre linfócitos e o vírus Ébola ou produtos genéticos solúveis. A importância de respostas precoces envolvendo células do sistema imunológico inato e/ou uma resposta rápida de anticorpos adaptativos é destacada por um estudo recente mostrando a proteção de primatas não humanos com administração de vacina pós-exposição35,

Embora os filovírus estejam entre os patógenos mais virulentos e fatais conhecidos, alguns pacientes infectados com o vírus ébola se recuperam da infecção. A identificação das diferenças na resposta imunológica entre casos fatais e não fatais é importante para o desenvolvimento futuro de terapias e vacinas eficazes. Diferenças específicas na apresentação clínica e nas respostas imunológicas foram observadas naqueles que sucumbiram em contraste com aqueles que se recuperam da infecção pelo vírus Ébola (Tabela 1). Esta comparação deixa claro que o desenvolvimento de uma resposta imunológica mediada por células específicas de antígenos está correlacionada com a depuração do vírus. Estudos demonstrando respostas imunológicas celulares específicas de antígenos em primatas não humanos vacinados que sobreviveram ao desafio do vírus Ebola infeccioso36,37,38 apóiam este achado. Além disso, constatou-se que a indução de uma resposta celular humoral e CD8+ T foi necessária para proteção em ratos desafiados com infecção letal pelo vírus Ébola39. Entretanto, o papel protetor das imunoglobulinas permanece incerto, pois um relatório recente indica que a transferência passiva do anticorpo monoclonal humano neutralizante KZ52 é incapaz de controlar a infecção em um modelo macaco40. Com base nestas considerações, torna-se cada vez mais evidente que uma resposta imunológica inata precoce e robusta, mas transitória, e a subsequente activação da resposta imunológica adaptativa são necessárias para proteger contra uma infecção fatal. Se essa resposta imunológica do hospedeiro não for gerada, o vírus foge ao controle imunológico, e a infecção progride para o estágio final da doença.

Patogênese da infecção

As alterações patológicas observadas em pacientes que morrem devido à infecção pelo vírus Ebola incluem anormalidades de coagulação, permeabilidade vascular, hemorragia e necrose e falência de órgãos. A hipótese atual é que o mecanismo fundamental da patogênese do vírus Ébola é a lesão vascular e os danos secundários às anormalidades da coagulação e ao aumento da permeabilidade vascular, devido à liberação de citocinas inflamatórias e quimiocinas por monócitos e macrófagos infectados e ativados, e aos danos celulares endoteliais diretos pela replicação viral tardia na infecção41,42. É evidente que, além da “tempestade de citocinas”, o próprio vírus também pode induzir imunossupressão e danificar diretamente as células hospedeiras4,43,44. Assim, as manifestações deletérias da infecção se originam em parte dos fatores secretados pelas células imunitárias disfuncionais e em parte dos danos induzidos viralmente nos tecidos e órgãos do hospedeiro.

Vírus Ebola mostra tropismo in vitro para células do sistema imunológico inato, bem como células endoteliais, células dendríticas e vários tipos de células epiteliais. A replicação ocorre a uma taxa invulgarmente elevada em células infectadas. A capacidade do vírus de se replicar em diferentes tipos de células é menos bem caracterizada in vivo. Além disso, a viremia em pacientes infectados é geralmente difícil de quantificar6; entretanto, uma carga viral superior a 106 unidades formadoras de placas por mililitro de soro (PFU/ml) foi observada em pelo menos um surto da espécie Zaire do Ébola45. A virémia em primatas não humanos infectados pode atingir até 107 PFU/ml46. Humanos com infecções fatais têm até 1010 cópias de RNA viral por mililitro, enquanto muito menos (107 cópias/ml) são encontradas no soro daqueles que sobrevivem à infecção pelo vírus do Ébola (ver Tabela 1)47. Altas taxas de replicação viral levam à lise e necrose nas células de muitos órgãos, incluindo o fígado, baço, rins e gônadas. Grande parte da necrose observada é induzida viralmente, pois há pouca infiltração nos tecidos infectados, e um número extraordinário de partículas virais está presente nos resíduos necróticos. Além disso, o exame microscópico dos tecidos humanos infectados mostra uma correlação entre a lesão tecidual e a presença de antígenos virais, ácido nucléico e locais de replicação viral4,43,44. Esta observação indica que a lesão viral direta de tecidos e órgãos pode levar à falência e choque de órgãos.

A infecção de certos tipos de células desempenha um papel importante na patogênese do vírus Ebola. Acredita-se que a infecção das células imunes inatas seja fundamental para a disseminação sistêmica do vírus durante a infecção humana8,10. Os monócitos e macrófagos infectados viajam do local da infecção para os linfonodos, onde mais monócitos e macrófagos são recrutados e depois se tornam alvos de infecção. A infecção destas células leva a uma maior amplificação e disseminação do vírus através do sistema linfático12. Além disso, a infecção e necrose dos hepatócitos causa comprometimento da função hepática. As enzimas hepáticas estão elevadas na maioria das infecções por filovírus48,49,50, e a diminuição da função hepática pode ser responsável pela diminuição da síntese de fatores de coagulação e pelo desenvolvimento de distúrbios de coagulação proeminentes durante a infecção fatal. Finalmente, o desenvolvimento do choque em estágios posteriores da doença é multifatorial e, juntamente com a hemorragia, pode ser devido em parte à infecção e necrose resultante das células do córtex adrenal50, já que essas células são importantes na regulação da pressão arterial.

Deficiência vascular e glicoproteínas do Ébola

Deficiência endotelial é uma característica proeminente da febre hemorrágica do Ébola. Uma perda de integridade vascular é frequentemente observada em humanos e primatas não humanos durante as fases tardias da doença e está associada a hemorragia e ao desequilíbrio de fluido entre os espaços dos tecidos. Os mecanismos completos que levam à permeabilidade do endotélio não foram elucidados. Vários estudos têm demonstrado que a liberação viral de mediadores inflamatórios aumenta a permeabilidade vascular in vitro11,51. Entretanto, células endoteliais são alvos de infecção durante estágios posteriores da doença e a citotoxicidade direta induzida pelo vírus das células endoteliais não pode ser descartada como mecanismo contribuinte para o aumento das manifestações hemorrágicas. De fato, a glicoproteína GP do envelope viral tem sido implicada como um dos principais determinantes da lesão das células vasculares.

GP é uma das proteínas do vírus Ebola mais estudadas devido à sua importância na entrada viral e potencial como um alvo para o desenvolvimento de vacinas. Como mencionado, também está sob intensa pesquisa devido ao seu possível papel na patogênese. A glicoproteína é responsável por direcionar o vírus para células que são relevantes para a patogênese. É provável que o GP tenha um papel na supressão imunológica através dos seus efeitos na desregulação das proteínas de superfície celular essenciais para a adesão de linfócitos e apresentação de antígenos52,53. Embora alguns tenham sugerido que os GP solúveis podem competir por anticorpos neutralizantes que, de outra forma, poderiam visar vírus ou células infectadas54,55, não foi demonstrado um papel protector para tais anticorpos, e a bioquímica e a reactividade dos anticorpos dos GP solúveis diferem dos do espigão de revestimento de membrana56,57. O GP solúvel inibe a ativação dos neutrófilos57, fornecendo um mecanismo adicional pelo qual a imunidade viral pode afetar a resposta inflamatória inata. A entrada do vírus ébola depende também das catepsinas endossômicas, enzimas críticas para a apresentação de antígenos58,59, e a liberação de catepsinas pode contribuir para danos celulares induzidos pelo vírus60,

Grupo de gravidade mostrou que o GP tem um efeito citotóxico direto. Yang e colegas descobriram que dos sete produtos do gene viral, o GP foi responsável pelo arredondamento e descolamento celular em células endoteliais tanto in vitro quanto ex vivo e que isso pode levar a um aumento substancial da permeabilidade vascular61. A expressão do GP das quatro espécies do vírus ébola induz graus variáveis de citotoxicidade em linhas celulares e células primárias in vitro que são caracterizadas pelo arredondamento e descolamento de células, seguido de morte celular61. Estes efeitos são mediados por um domínio da mucina fortemente glicosilada da glicoproteína. Embora haja algum debate sobre o papel da citotoxicidade do GP durante a infecção viral viva62, as diferenças na citotoxicidade induzida pelo GP estão correlacionadas com as taxas de mortalidade das diferentes espécies virais52,61, sugerindo que este produto gênico é importante na patogênese da doença. A expressão da GP ligada à membrana parece ser precisamente controlada durante a replicação viral por um mecanismo envolvendo a edição transcripcional pela polimerase viral63. Isto indica que a glicoproteína pode ser um determinante viral chave da patogenicidade durante a infecção.

Assim, fatores induzidos pelo vírus e pelo hospedeiro se combinam para resultar em uma via destrutiva na qual uma resposta fatal à infecção pelo vírus Ebola se correlaciona invariavelmente com a supressão da imunidade mediada por células B e T. Os doentes que não conseguem recuperar praticamente não têm anticorpos específicos de antigénios virais. Quantidades baixas de imunoglobulina específica Ms estão presentes em apenas 30% dos doentes fatalmente infectados e não são detectados Gs específicos de imunoglobulina30,64,65. Parece haver um início limitado das respostas das células T citotóxicas ou CD4+ helper T, muito provavelmente devido à sua depleção em casos fatais. A depleção linfocitária é susceptível de exacerbar a replicação viral descontrolada dentro dos macrófagos e outras células inflamatórias. Portanto, a infecção fatal pelo vírus Ebola é caracterizada por imunossupressão ampla, tipificada pelo desenvolvimento de uma resposta imunológica inata não-específica e deletéria aberrante e pouca ou nenhuma estimulação de uma resposta adaptativa específica ao antígeno. Esta falta de resposta leva a uma sobrecarga viral esmagadora e à consequente patologia imunológica e mediada por vírus.

Relevância para outros patógenos altamente letais e pesquisas futuras

Percepções valiosas sobre características críticas do sistema imunológico do hospedeiro podem ser obtidas a partir de um exame da resposta imunológica a patógenos altamente virulentos como o vírus Ébola. Uma tendência que parece estar emergindo é que patógenos letais e agudos tendem a matar rapidamente, antes do desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa, enquanto patógenos crônicos podem sobreviver e se replicar apesar de uma resposta imune adaptativa. A este respeito, existem paralelos interessantes entre a infecção pelo vírus Ebola e o vírus da influenza altamente patogênico de 1918 (ver a revisão de Ahmed e colegas66). Por exemplo, Kobasa e colegas de trabalho descobriram que uma cepa reconstituída de influenza de 1918 mostra altos níveis de replicação viral, que se correlaciona com lesões macroscópicas no tecido pulmonar de cynomolgus macaques infectados67. A infecção neste modelo animal culminou em angústia respiratória aguda e um resultado esmagadoramente fatal. Curiosamente, os animais infectados foram capazes de montar uma resposta imunológica que foi, em muitos aspectos, semelhante às respostas observadas durante a infecção pelo Ébola em primatas não humanos. A resposta imunológica à influenza de 1918 foi caracterizada por uma resposta aberrante de interferon e a expressão de níveis anormalmente altos de citocinas e quimiocinas. Os autores concluíram que a alta letalidade da cepa de influenza de 1918 pode ser atribuída em parte à geração de uma resposta imune inata atípica e prejudicial que é insuficiente para proteção.

Uma comparação das respostas imunes aos vírus do Ébola e da influenza de 1918 indica que a alta letalidade destes vírus pode originar-se de uma combinação dos efeitos deletérios de altos títulos virais e dano viral direto e uma resposta imune inata não-específica e anormalmente sustentada. Um quadro semelhante de viremia esmagadora, falta de controlo pela resposta imunitária inata e incapacidade de desenvolver imunidade adaptativa foi observado também com outros vírus altamente letais, incluindo o coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SRA), vírus Marburg, vírus da febre de Lassa e outros. Em cada caso, parece que o vírus causa uma infecção letal através da sua esmagadora replicação, embora os receptores específicos, tropismos celulares e orgânicos, mecanismos de fuga à inflamação e imunidade e reservatório natural possam diferir.

Muitas questões permanecem por resolver no que diz respeito aos mecanismos e extensão total da desregulação imunitária induzida pelo vírus. Por exemplo, o mecanismo da apoptose linfocitária é desconhecido. O vírus ébola não visa directamente estas células, no entanto o seu número é rapidamente esgotado uma vez que os títulos virais são mensuráveis no hospedeiro. Estas células entram numa diferenciação terminal anergica devido a desequilíbrios locais de citocinas, ou existe uma destruição aberrante do alvo por outras células imunitárias? Também não se sabe se o vírus ébola mostra tropismo para uma determinada DC que pode aumentar a evasão da resposta antiviral. O mecanismo pelo qual a apresentação do antígeno DC é prejudicada é desconhecido. O papel da catepsina na imunopatogenia também não é completamente compreendido; como as catepsinas também contribuem para o processamento do antígeno, é possível que elas também afetem a resposta imunológica adaptativa. Questões similares permanecem quanto aos detalhes da replicação viral in vivo. Embora o vírus Ebola possa ser encontrado através da imuno-contaminação de uma variedade de tipos de células, incluindo macrófagos, CD e células endoteliais, o vírus liga-se a receptores de lectina ubíquos em muitas destas células; assim, não é claro se a presença do vírus em uma determinada célula representa uma replicação ativa ou se meramente se liga à superfície da célula. Finalmente, o papel da tempestade de citocinas versus citotoxicidade viral directa às células endoteliais continua a ser objecto de muita especulação mas, infelizmente, muito poucos dados.

Muitas destas questões, incluindo o papel de partes específicas do sistema imunitário na protecção, podem ser resolvidas com estudos que utilizam a depleção de anticorpos in vivo contra citocinas, receptores de citocinas e subconjuntos de linfócitos em modelos de infecção por primatas não humanos. Até que estas importantes questões sejam abordadas, as hipóteses atuais explicam a fisiopatologia induzida pelo vírus Ebola em termos gerais: uma combinação de fatores, incluindo respostas inflamatórias descontroladas e inespecíficas, imunossupressão induzida por vírus e destruição viral direta de vários tipos celulares, contribuem coletivamente para o colapso do sistema vascular, falência de múltiplos órgãos e síndrome tipo choque da infecção letal pelo vírus Ebola.