Dose e Efeitos no Tempo da Ingestão de Cafeína em Plaquetas Humanas Receptores de Adenosina A2A

A cafeína, encontrada em diferentes fontes como café, chá, chocolate e bebidas de cola, é a substância mais amplamente ativa no mundo. O consumo médio de cafeína pelos adultos varia entre diferentes culturas e nações de 80 a 400 mg por pessoa por dia.1 A cafeína provoca um número diverso de respostas farmacológicas, incluindo aumento da vigilância, diminuição do tempo de reação psicomotora e aumento da latência do sono e do tempo de vigília, podendo também influenciar o desempenho intelectual.2 Além disso, a cafeína causa relaxamento da musculatura lisa, aumenta a secreção de ácido gástrico e a liberação de catecolaminas, e aumenta a atividade metabólica.3

O(s) mecanismo(s) preciso(s) subjacente(s) às ações da cafeína permanece(m) mal definido(s). Embora a inibição das fosfodiesterases possa contribuir para as ações da cafeína4, há evidências crescentes de que a maioria dos efeitos farmacológicos dessa xantina resulta do antagonismo dos receptores de adenosina designados como subtipos A1, A2A, A2B e A3.5 A cafeína atua de forma mais potente nos receptores A2A, seguida de perto pelos receptores A1, depois A2B,6 e como um antagonista fraco nos receptores A3 humanos. O bloqueio por cafeína dos receptores de adenosina, nomeadamente os tipos A1 e A2A, inibe a acção da adenosina endógena numa variedade de processos fisiológicos.7 Em condições normais, os níveis sanguíneos de adenosina parecem ser suficientes para activar tonicamente os receptores A2A nas plaquetas. Recentemente, em ratos receptores A2A, foi relatado que a agregação plaquetária foi aumentada, indicando a importância deste subtipo de receptor na função plaquetária.8 Portanto, é possível que a cafeína possa bloquear esses receptores A2A ativados tonicamente nas plaquetas e alterar suas funções moduladas pela adenosina.

Há muitos anos, suspeita-se de uma associação entre o consumo de café e doenças cardiovasculares, em particular doenças coronarianas,9 mas recentemente foi demonstrado que o consumo de café ou cafeína não aumenta o risco de doenças coronarianas ou acidentes vasculares cerebrais.1011 Numerosos estudos epidemiológicos considerando o infarto do miocárdio não encontraram efeito deletério de <5 xícaras de café por dia, enquanto os resultados são controversos em níveis de ingestão mais altos.12 Em pacientes com hipertensão, não foi observado risco de desfecho adverso em nenhum nível de ingestão de cafeína.13

Um estudo de Biaggioni et al14 constatou que um regime de dosagem repetida de cafeína leva a alterações significativas nas plaquetas humanas nas respostas funcionais ao agonista receptor de adenosina 5′-N-ethylcarboxamidoadenosina (NECA). A retirada da cafeína produziu um significativo deslocamento para a esquerda da inibição de agregação induzida pela NECA.14 Consistente com isso, recentemente demonstramos,15 em indivíduos tratados com 750 mg/d durante 1 semana, que a ingestão crônica de cafeína altera a agregabilidade plaquetária como resultado da upregulação dos receptores A2A localizados na superfície plaquetária.

No presente artigo, fornecemos mais evidências de que uma resposta similar é encontrada em indivíduos tratados com cafeína em doses diferentes, como 600 mg/d durante 1 semana ou 400 mg/d, administrados por um período mais longo, como 2 semanas. No presente estudo, isso foi feito medindo diretamente as alterações do receptor de adenosina A2A (densidade e afinidade) e sua função, determinando o efeito do agonista seletivo 2-hexynyl-NECA (HE-NECA) A2A para (1) aumentar o acúmulo de AMPc, (2) inibir a agregação plaquetária e (3) diminuir os níveis intracelulares de cálcio. Após o consumo crônico (600 mg/d durante 1 semana ou 400 mg/d durante 2 semanas), foi encontrada upregulação dos receptores de adenosina plaquetária A2A, que foi altamente correlacionada com efeitos antiagregadores, um aumento do acúmulo de AMPc e uma diminuição dos níveis de cálcio intracelular. Não foram reveladas diferenças nos parâmetros de ligação e funcionais de sujeitos tratados com 400 mg/d durante 1 semana.

Métodos

Foram estudados 45 sujeitos saudáveis, não fumantes, de 25 a 45 anos de idade, de ambos os sexos. Após o consentimento informado por escrito, os sujeitos foram solicitados a se absterem de metilxantinas dietéticas por ≥2 semanas. Eles foram divididos em 3 grupos (15 sujeitos cada) de acordo com o regime de administração de cafeína (ou seja, dose e duração da administração): 200 mg por via oral 2 vezes ao dia por um período de 7 dias (grupo 1); 200 mg por via oral 2 vezes ao dia por um período de 14 dias (grupo 2); e 200 mg por via oral 3 vezes ao dia por um período de 7 dias (grupo 3). As plaquetas destes sujeitos foram estudadas antes do início da cafeína (dia 0) e às 1, 12, 60, e 108 horas após a última dose de cafeína. Em particular, o tempo de 1 hora foi estudado apenas no grupo que recebeu a dose máxima de cafeína (600 mg/d). EC50 e IC50 em ensaios funcionais não puderam ser obtidos a 1 hora devido aos problemas práticos ligados à retirada excessiva de sangue num período de tempo estreito (1 a 12 horas).

SCH 58261 Ensaio de ligação em membranas plaquetárias humanas

Membranas de plaquetas humanas foram preparadas como descrito anteriormente16 e utilizadas para ensaios de ligação radioligand com SCH 58261 de acordo com Varani et al.17 Em estudos de saturação, as membranas plaquetárias humanas foram incubadas com 8 a 10 concentrações diferentes de SCH 58261 variando de 0,01 a 10 nmol/L. A ligação inespecífica foi determinada na presença do NECA 10 μmol/L. Após 60 minutos de incubação a 4°C, as amostras foram filtradas através dos filtros Whatman GF/B com um Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co). Um programa de ajuste não-linear de mínimos quadrados, LIGAND,18 foi utilizado para análise dos dados dos experimentos de saturação por computador.

Medição dos níveis de cAMP em plaquetas humanas

Plaquetas humanas lavadas obtidas do sangue periférico de voluntários saudáveis foram preparadas como descrito anteriormente.16 Plaquetas (6×104 a 8×104 células) foram incubadas com 1,0 U de adenosina deaminase/mL, 0,5 mmol/L 4-(3-butoxi-4-metoxibenzil)-2-imidazolidinona (Ro 20-1724) como inibidor da fosfodiesterase, e 6 a 8 concentrações diferentes de HE-NECA. Os valores de EC50 foram obtidos das curvas concentração-resposta após transformação log-logit das variáveis dependentes pelo método dos mínimos quadrados ponderados.19 A solução aquosa final foi testada para os níveis de AMPc por um ensaio de ligação de proteínas de competição.15

Ensaio de agregação de plaquetas

Sangue humano foi centrifugado a 200g durante 10 minutos para obter plasma rico em plaquetas e a 2500g durante 20 minutos para obter plasma pobre em plaquetas. A contagem de plaquetas humanas foi realizada em um Contador Coulter modelo S8/80 (Coulter Electronics Inc) e ajustada para 2,5×108/mL a 3,5×108/mL com plasma autólogo pobre em plaquetas. A agregação plaquetária foi realizada de acordo com a técnica turbidimétrica Born20 com um gravador de agregados DIC PA-3220 (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Após incubação por 3 minutos com 6 a 8 concentrações diferentes de HE-NECA, o plasma rico em plaquetas foi agregado a 37°C sob agitação contínua com ADP. Experiências similares foram realizadas com ADP em diferentes concentrações (100 nmol/L a 100 μmol/L). A agregação máxima, registrada 5 minutos após a adição do ADP, foi utilizada para a análise quantitativa, e a porcentagem de inibição foi calculada em relação aos valores de controle.21

Cytoplasmic Free Ca2+ Concentration Measurements

Cytosolic free calcium concentration was measured by use of the fura 2 technique according to Paul et al.22 Em resumo, as plaquetas foram incubadas em escuridão total por 30 minutos a 37°C com 1 μmol/L fura 2-AM e agitadas magneticamente em cuvetes fluorímetros (LS50, Perkin Elmer, Ltd) a uma concentração de 108/mL na presença de 250 μmol/L sulfinpirazona. A concentração intracelular de Ca2+ (i) foi determinada a uma razão de excitação de 340/380 e um comprimento de onda de emissão de 505 nm.

Análise estatística

Análise dos dados foi realizada por ANOVA de 1 via. A análise da diferença entre os grupos tratados com cafeína (12, 60 e 108 horas) e os sujeitos controle foi feita com o teste t de Student (análise não pareada). As diferenças foram consideradas significativas com um valor de P<0,01. Todos os dados são relatados como média±SEM.

Resultados

Platelets dos 3 grupos de sujeitos foram colhidos antes do início da administração de cafeína (dia 0, controle) e às 1, 12, 60 e 108 horas após a última dose (retirada de cafeína). A Tabela resume os resultados dos experimentos de ligação e funcionais dos 3 grupos de indivíduos.

Grupo 1 (400 mg/d durante 1 semana)

Parâmetros de ligação revelaram um valor Bmax de controle de 105±6 fmol/mg de proteína e um valor KD de 1,28±0,08 nmol/L. Em plaquetas de controle, HE-NECA aumentou os níveis de cAMP com um EC50 de 60±5 nmol/L e inibiu (1) a agregação com um IC50 de 86±10 nmol/L e (2) os níveis de cálcio com um IC50 de 104±8 nmol/L. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nos parâmetros de ligação e funcionais às 12, 60 e 108 horas após a retirada da cafeína (Tabela).

Grupo 2 (400 mg/d durante 2 Semanas)

Parâmetros de ligação revelaram um valor Bmax de controle de 110±3 fmol/mg de proteína e um valor KD de 1,21±0,09 nmol/L. Às 12 e 60 horas após a retirada da cafeína, a densidade do receptor, Bmax, aumentou em ambos os pontos de tempo em cerca de 20%, mas os valores de KD permaneceram inalterados. Experimentos funcionais revelaram que o agonista receptor de adenosina A2A HE-NECA foi significativamente mais potente no aumento do AMPc plaquetário (ou seja, os valores de EC50 foram 45% e 65% menores em 12 e 60 horas após a retirada da cafeína do que os valores de controle, respectivamente). Uma tendência semelhante foi observada nos valores de IC50 obtidos em experimentos de agregação e nas medidas de concentração de cálcio livre de citoplasma (Tabela).

Grupo 3 (600 mg/d durante 1 Semana)

Overall, obtivemos dados semelhantes aos do grupo 2. SCH 58261 ligado a uma única classe de afinidade de sítios nas membranas plaquetárias a partir de controles com um Bmax de 100±4 fmol/mg de proteína e um KD de 1,27±0,09 nmol/L. Como mostrado na Figura 1A, em membranas de plaquetas colhidas a 1, 12, 60 e 108 horas após a retirada da cafeína, a radioligand ligada com a mesma afinidade, mas o número de sítios de ligação (Bmax) aumentou significativamente (P<0,01). Em estudos paralelos, foram determinadas as respostas funcionais das plaquetas ao agonista receptor A2A HE-NECA. Como resumido na Tabela, a potência do HE-NECA para (1) aumentar a formação de AMPc, (2) inibir a agregação plaquetária induzida pelo ADP, e (3) diminuir os níveis de cálcio foi significativamente aumentada nas plaquetas obtidas às 12, 60 e 108 horas após a retirada da cafeína (Figura 1B, 1C, e 1D). Também foram realizados experimentos para determinar se o aumento da densidade dos receptores A2A seria acompanhado por uma diminuição da potência e/ou eficiência do ADP para induzir a agregação. Os valores de EC50 do ADP para estimular a agregação plaquetária às 12, 60 e 108 horas após a retirada da cafeína foram de 0,7±0,2, 0,9±0,1 e 0,8±0,1 μmol/L, respectivamente, valores não significativamente diferentes dos 0,9±0.2 μmol/L obtido em plaquetas de controle (Figura 2).

Discussão

Os efeitos da administração prolongada de cafeína em humanos e animais e seu papel na tolerância às ações da cafeína são controversos. Alguns estudos mostrando um aumento dos receptores A1 no cérebro de ratos encontraram evidências de uma upregulação dos receptores A1 dependente da dose pela cafeína.23 Outros estudos revelaram uma upregulação dos receptores A2A, sugerindo um efeito adaptativo da ingestão de cafeína.24 Além disso, o consumo crônico de cafeína pode levar a uma redução na agregabilidade plaquetária como resultado da upregulação dos receptores A2A localizados na superfície plaquetária14 desempenhando um papel potencial nos processos fisiopatológicos, tais como agregação e trombogênese. Embora tais alterações possam contribuir para alterações na função plaquetária, a tolerância à cafeína não modifica a potência desta xantina como antagonista competitivo dos efeitos da adenosina.25 Outras alterações, como a mudança de afinidade dos receptores para um estado de alta afinidade, alterações nos níveis de proteína G ou o acoplamento destas proteínas aos receptores de adenosina, ou a ocupação dos receptores a longo prazo, podem estar envolvidas no fenômeno da tolerância.26 Os sintomas de retirada da cafeína ocorrem em humanos; tipicamente, são dor de cabeça, fadiga, apatia e sonolência.9 Em particular, a cafeína aumenta a concentração plasmática de adenosina, e sua redução após a retirada do antagonista sugere regulação mediada por receptores da concentração plasmática de adenosina.27 Durante a isquemia e/ou hipoxia, a adenosina também tem ações neuroprotetoras. No cérebro adulto, o tratamento com cafeína crônica, que leva à upregulação dos receptores de adenosina, reduz o dano isquêmico, enquanto que a exposição aguda (efeito antagônico dos receptores) aumenta o dano isquêmico.28

Foi demonstrado que a ingestão crônica de cafeína altera a resposta das plaquetas às ações da adenosina.14 A administração repetida de cafeína (750 mg/d durante 1 semana) revelou um aumento na densidade receptora A2A, acompanhada de sensibilização das respostas plaquetárias, como aumento do acúmulo de AMPc e diminuição da agregação plaquetária.15 O objetivo do presente estudo foi determinar o efeito da dosagem de cafeína e da duração da administração sobre os parâmetros de ligação e funcionais. Assim, estudamos as alterações na densidade e afinidade dos receptores de adenosina A2A nas membranas plaquetárias humanas de indivíduos tratados com diferentes doses (400 ou 600 mg/d) durante diferentes períodos de ingestão de cafeína (1 ou 2 semanas). Especificamente, estudamos sujeitos controlados (antes da administração de cafeína) e tratados com cafeína (1, 12, 60, e 108 horas após a última dose de cafeína).

O tratamento com 400 mg/d de cafeína durante 1 semana não modificou a ligação dos receptores A2A e os parâmetros funcionais. Entretanto, o tratamento com 400 mg/d durante 2 semanas ou 600 mg/d durante 1 semana resultou em (1) um aumento significativo (upregulação) dos sítios de ligação da adenosina A2A, (2) um aumento no acúmulo de AMPc, (3) um aumento dos efeitos antiagregadores, e (4) uma diminuição nos níveis de cálcio provocada pelo agonista receptor A2A HE-NECA.

A upregulação dos receptores A2A pode provavelmente ser atribuída à síntese de novos receptores durante a diferenciação das células precursoras. Esta interpretação é baseada nos resultados de experimentos in vitro mostrando que a incubação de plasma rico em plaquetas de sujeitos de controle por um período de 6 ou 12 horas com cafeína ou SCH 58261 não afetou os parâmetros de ligação.15 A upregulação dos receptores de adenosina A2A causada pela ingestão crônica de cafeína poderia ser interpretada para indicar que a adenosina endógena tem uma influência tônica nas plaquetas humanas, e a presença do antagonista é contrabalançada pela upregulação dos receptores A2A. Em adultos, a cafeína é adsorvida eficazmente do tracto gastrointestinal; os picos de concentração plasmática ocorrem 15 a 120 minutos após a ingestão, e a meia-vida da cafeína é de 2,5 a 4,5 horas.7 O aumento dos receptores de adenosina A2A encontrado 1 hora após a última dose de tratamento com cafeína foi semelhante ao obtido 12 ou 60 horas após a retirada da cafeína, mostrando que a retirada não foi necessária para a upregulação dos receptores A2A.

Outro objetivo do presente estudo foi determinar se as mudanças nos parâmetros de ligação correlacionadas com as mudanças nas respostas funcionais. Verificou-se que a agregação plaquetária estava associada à ativação da adenilato ciclase e a um aumento das concentrações intracelulares de cálcio. A potência da HE-NECA às 12, 60 e 108 horas após a retirada da cafeína foi significativamente aumentada em comparação com o grupo controle. Este achado indica que a administração repetida de diferentes doses de cafeína leva a mudanças significativas no número de receptores A2A na superfície plaquetária, acompanhadas por uma maior capacidade de resposta à estimulação dos receptores. O receptor clássico de adenosina A2A é responsável pelas propriedades antiagregatórias da adenosina e seus análogos, o que é consistente com a observação de que a agregação é mais eficiente em ratos sem os receptores A2A.8 No entanto, a agregação plaquetária induzida pelo aumento das concentrações de ADP não foi significativamente diferente entre indivíduos controlados e tratados com cafeína. Uma explicação possível para esta última observação é que não há adenosina suficiente no meio de ensaio para produzir uma resposta. Alternativamente, nos indivíduos tratados com cafeína, a magnitude da upregulação do receptor (ou seja, número de receptores) não foi suficiente para produzir uma mudança na curva concentração-resposta da agregação induzida pelo ADP. Entretanto, quando os níveis de adenosina endógena aumentam, como durante a isquemia miocárdica, a concentração extracelular de adenosina sobe rapidamente para um nível suficiente para atuar sobre receptores upregulados e pode ter maiores efeitos inibidores das plaquetas do que o controle. Assim, é possível que o consumo crônico de cafeína em doses não muito distantes da ingestão alimentar média possa levar a uma redução paradoxal na agregabilidade plaquetária durante a isquemia.

Em conclusão, todos os dados juntos fornecem evidências adicionais de que a ingestão crônica de cafeína altera a resposta das plaquetas às ações da adenosina. A principal conclusão do presente estudo é que os efeitos do consumo crônico de cafeína nas funções plaquetárias dependem tanto da dose quanto da duração do tratamento e estão subjacentes a uma redução na agregabilidade plaquetária devido à upregulação dos receptores de adenosina A2A.

Footnotes