Cromatografia líquida de alta performance (HPLC) é uma forma de cromatografia em coluna que bombeia uma mistura de amostra ou analito em um solvente (conhecida como fase móvel) a alta pressão através de uma coluna com material de embalagem cromatográfica (fase estacionária). A amostra é transportada por um fluxo de gás portador móvel de hélio ou nitrogênio. A HPLC tem a capacidade de separar e identificar compostos presentes em qualquer amostra que possam ser dissolvidos num líquido em concentrações vestigiais tão baixas quanto partes por trilhão. Devido a esta versatilidade, o HPLC é usado em uma variedade de aplicações industriais e científicas, tais como farmacêuticas, ambientais, forenses e químicas.
O tempo de retenção da amostra variará dependendo da interação entre a fase estacionária, as moléculas sendo analisadas, e o solvente, ou solventes utilizados. medida que a amostra passa pela coluna, ela interage entre as duas fases a um ritmo diferente, principalmente devido a diferentes polaridades nos analitos. Os analitos que têm a menor quantidade de interação com a fase estacionária ou a maior quantidade de interação com a fase móvel sairão mais rapidamente da coluna.
Instrumentação:
Os principais componentes de um sistema HPLC incluem o reservatório de solvente, ou múltiplos reservatórios, uma bomba de alta pressão, uma coluna, sistema injetor e o detector.
Limite de detecção |
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Recomendação de gás |
>
Recomendação de regulador |
| Gás de exaustão | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Helium 5.0 | BASELINA C106 série |
O reservatório contém o solvente, que é referido como a fase móvel porque se move. Há normalmente um mínimo de dois reservatórios em um sistema, com cada um segurando até 1000 cc de solvente e normalmente equipado com um difusor de gás através do qual o hélio pode ser borbulhado. Uma bomba é utilizada para gerar um fluxo específico da fase móvel. Embora a injeção manual de amostras ainda seja possível, a maioria dos HPLCs são agora totalmente automatizados e controlados por computador. O injetor, ou auto amostrador, introduz o solvente em um fluxo de fase que transporta a amostra para a coluna de alta pressão (até 400 bar), que contém material de embalagem específico necessário para efetuar a separação. O material de embalagem é chamado de fase estacionária porque é mantido no lugar pelo hardware da coluna.
Um detector é necessário para ver as bandas compostas separadas à medida que elas se eluem da coluna de alta pressão. A informação é enviada do detector para um computador que gera o cromatograma. A fase móvel sai do detector e é enviada para um resíduo, ou recolhida, conforme desejado.
Aquecimento do hélio é um método eficaz de desgaseificação da fase móvel para evitar linhas de base instáveis causadas por ar dissolvido. O nitrogênio é utilizado como gás de nebulização no Detector de Dispersão de Luz Evaporativa (ELSD) onde o solvente é evaporado da amostra deixando uma névoa como é medida.
Ultra Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (uHPLC):
Quando a HPLC padrão usa normalmente partículas de coluna com tamanhos de 3 a 5µm e pressões de cerca de 400 bar, a uHPLC usa colunas especialmente projetadas com partículas de até 1,7µm de tamanho, a pressões superiores a 1000 bar. A principal vantagem de uma uHPLC é a velocidade. Estes sistemas são mais rápidos, mais sensíveis e dependem de volumes menores de solventes orgânicos do que o HPLC padrão, resultando na capacidade de executar mais amostras em menos tempo. Entretanto, se os sistemas são executados a pressões típicas superiores a 800 bar, as colunas envelhecem, ou se degradam mais rapidamente. Está sendo desenvolvida uma tecnologia mais recente para unidades de uHPLC para usar partículas de coluna com 1µm de tamanho, e potenciais de pressão de até 6.800 bar.
uHPLC também é conhecido como UPLCTM, uma marca registrada da Waters Corporation.
Cromatografia líquida rápida de proteínas (FPLC):
FPLC é um sistema similar à cromatografia líquida de alto desempenho que é usada para separar ou purificar proteínas e outras biomoléculas de misturas complexas. A principal diferença entre a FPLC e a HPLC é a pressão de trabalho padrão. As colunas de FPLC só podem ser utilizadas até pressões máximas de 3-5 MPa. Se a pressão da HPLC pode ser limitada, quase todas as colunas FPLC também podem ser usadas em um sistema HPLC.