2 Physiological Evidence of Endozepines
The synthesis of RO 15-1788 (or flumazenil, FLZ), the first known BZ antagonist (Hunkeler et al, 1981; Ramerstorfer, Furtmüller, Vogel, Huck, & Sieghart, 2010), facilitaram um grande conjunto de pesquisas apoiando a hipótese de que os ligandos endógenos ao local de ligação BZ existem e são funcionalmente relevantes in vitro e in vivo. Embora o FLZ tenha sido uma ferramenta valiosa para a identificação de ações fisiológicas de BZ, sua utilização para este fim tem limitações. Por exemplo, foi demonstrado que o FLZ pode exercer efeitos PAM em GABAARs heterologicamente expressos, especialmente em concentrações elevadas (Ramerstorfer et al., 2010). É importante ressaltar que FLZ nunca demonstrou ter efeitos do NAM em GABAARs heterologicamente expressos, sugerindo que qualquer efeito NAM do FLZ na inibição mediada por GABA é muito provavelmente devido ao antagonismo de um ligante endógeno.
Estudos in vitro sugeriram uma série de circuitos nos quais os endozepínicos são constitutivamente expressos e fisiologicamente ativos, como evidenciado pelos efeitos supressores do FLZ na inibição mediada por GABA, principalmente através de uma diminuição da duração da resposta. Por exemplo, FLZ suprime IPSP(C)s em hipocampus (King, Knox, Dingledine, 1985; Krespan, Springfield, Haas, & Geller, 1984) e em culturas neocorticais neuronais (Vicini et al., 1986). FLZ demonstrou suprimir a inibição em células de giro dentado no modelo de pilocarpina da epilepsia do lobo temporal (Leroy, Poisbeau, Keller, & Nehlig, 2004) e suprimir a inibição em neurônios neocorticais piramidais de camada II/III (Ali & Thomson, 2008). A potencialização a longo prazo das sinapses inibitórias na área hipocampal CA1 foi associada a um aumento na amplitude IPSC que foi suprimida por FLZ (Xu & Sastry, 2005). Mais recentemente, foi demonstrado que o FLZ suprime os neurônios de inibição sináptica do núcleo reticular talâmico (nRt, Christian et al., 2013), indicando a presença de uma endozepina neste núcleo. Juntos, estes estudos com FLZ apoiam fortemente a presença de atividade endógena PAM em várias regiões cerebrais distintas, indicando que este é um mecanismo modulatório endógeno amplamente implementado no SNC.
Um número de achados clínicos interessantes é consistente com o antagonismo FLZ da função endozepínica. Por exemplo, o tratamento FLZ pode induzir ataques de pânico em pacientes com distúrbio de pânico, mas não em controles saudáveis (Nutt, Glue, Lawson, & Wilson, 1990). Também pode precipitar maior resposta de pânico em mulheres com distúrbio disfórico pré-menstrual em comparação aos controles (Le Mellédo, Van Driel, Coupland, Lott, & Jhangri, 2000) e reverter o estupor associado à encefalopatia hepática (Als-Nielsen, Gluud, & Gluud, 2004; Baraldi et al., 2009). Juntos estes estudos sugerem um papel fisiológico para um acúmulo de endozepinas no espaço extracelular, ou seja, um acúmulo fisiológico, na regulação da ansiedade/pânico. Além disso, os níveis séricos de substâncias que inibem a ligação FLZ às membranas cerebelares de ratos foram relatados para aumentar duas vezes durante o parto por parto espontâneo, um efeito não observado em pacientes submetidas à cesárea (Facchinetti, Avallone, Modugno, & Baraldi, 2006), sugerindo que estados fisiológicos como o parto podem causar acúmulo de endozepina.
A relevância desses achados para pacientes de epilepsia humana permanece desconhecida no momento, uma vez que as evidências das ações endozepínicas em pacientes com epilepsia são inconclusivas. FLZ pode provocar convulsões em pacientes, mas pelo menos alguns pacientes estavam provavelmente recebendo tratamento BZ (Spivey, 1992). Por exemplo, em uma série de 67 pacientes submetidos a avaliação antes da cirurgia de epilepsia (Schulze-Bonhage & Elger, 2000), as convulsões foram provocadas em 8 (12%) – todas tinham sido previamente tratadas com BZs. Relatos de casos sugerem piora das convulsões por FLZ em lactentes e idosos (McDuffee & Tobias, 1995; Thomas, Lebrun, & Chatel, 1993). Os efeitos relatados da FLZ sobre as convulsões em estudos com animais também são mistos. Em ratos com menos de 2 semanas, a FLZ agrava as convulsões motoras menores induzidas por PTZ (Rathouská, Kubová, Mares, & Vorlícek, 1993). Notavelmente em modelos de alta dose de convulsões, ou a supressão da atividade convulsiva (Kaijima, Le Gal La Salle, & Rossier, 1983) ou nenhum efeito (Hunkeler et al., 1981) tem sido relatado. No modelo GAERS de epilepsia espontânea de ausência genética, FLZ teve efeitos dependentes da concentração, com baixas doses suprimindo as descargas de picos de onda (SWDs) e doses mais altas aumentando-as (Marescaux et al., 1984). Além disso, uma mutação genética (R43Q) na subunidade humana γ2 associada tanto à ausência familiar quanto às convulsões febris foi mostrada para abolir (Wallace et al., 2001) ou reduzir (Bowser et al., 2002) a sensibilidade in vitro de GABAARs específicos para DZP. Ainda não se conhece o mecanismo de aumento da atividade convulsiva relacionada à insensibilidade do receptor à DZP, um ligante exógeno. Uma hipótese provocativa é que a mutação torna os receptores insensíveis a uma BZ endógena que ocorre naturalmente. Uma vez que uma BZ endógena provavelmente teria propriedades antissépticas, mutações no receptor que impedem a ligação da BZ endógena causariam convulsões. Entretanto, o tráfico receptor também é afetado por essa mutação (Kang & Macdonald, 2004; Sancar & Czajkowski, 2004) e poderia contribuir para a atividade de apreensão, portanto o papel das endozepinas nas apreensões relacionadas à mutação de γ2R43Q continua controverso.
FLZ também tem sido relatado para reverter estupor idiopático recorrente (Rothstein et al, 1992), embora nos últimos anos tenha se tornado evidente que pelo menos alguns pacientes que responderam à FLZ tinham uso sub-reptício de BZ (Granot, Berkovic, Patterson, Hopwood, & Mackenzie, 2004) e este campo permanece controverso (Cortelli et al., 2005). Em um estudo recente, a FLZ normalizou a vigilância em um grupo bem caracterizado de pacientes com hipersônia. Uma atividade PAM peptidérgica foi encontrada no líquido cefalorraquidiano (LCR) desses pacientes (Rye et al., 2012). No entanto, a PAM não interagiu com uma potencialização pelo midazolam BZ e persistiu parcialmente em α1(H101R), GABAARs com uma mutação pontual tornando-os BZ insensíveis, indicando que pode não ser um agente de imitação de BZ clássico (Rye et al., 2012). A identidade deste PAM do LCR e seu papel na fisiopatologia da hipersônia permanecem desconhecidos.